Un protocole structuré est présentée pour un dosage à base de cellules comme un test fonctionnel pour prédire le pronostic de la scoliose idiopathique de l'utilisation de la spectroscopie diélectrique cellulaire (CDS). Le dosage peut être effectué avec des cellules mononucléaires de sang périphérique fraîches ou congelées (PBMC) et la procédure est terminée en moins de 4 jours.
Ce protocole détaille la procédure expérimentale et analytique pour un essai à base de cellules développées dans notre laboratoire comme un test fonctionnel pour prédire le pronostic de la scoliose idiopathique chez les enfants asymptomatiques et affectées. Le test consiste en l'évaluation de l'état fonctionnel de Gi et Gs protéines dans des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) par la spectroscopie diélectrique cellulaire (CDS), en utilisant un instrument à base CDS automatisé, et la classification des enfants en trois groupes fonctionnels (FG1 , GR2, GR3) par rapport au profil du déséquilibre entre le degré de réponse à Gs et Gi protéines stimulation. La classification est en outre confirmée par l'effet différentiel de l'ostéopontine (OPN) sur la réponse à la stimulation Gi entre les groupes et la progression rapide de la maladie est référencé par FG2. Environ, un volume de 10 ml de sang est nécessaire pour extraire des PBMC par gradient de Ficoll-cellules et sont ensuite stockés dans de l'azote liquide. Le nombre adéquat de PBMC pour réaliser le dosage est obtenu après deux jours de culture cellulaire. Essentiellement, les cellules sont d'abord incubées avec phytohemmaglutinin (PHA). Après 24 heures d'incubation, milieu est remplacé par un milieu de culture sans PHA pour une 24 heure supplémentaire avant l'ensemencement des cellules et le traitement OPN. Les cellules sont ensuite examinés par spectroscopie pour leurs réponses à la somatostatine et de l'isoprotérénol, qui activent respectivement les protéines Gi et Gs par leurs récepteurs apparentés. Tant la somatostatine et de l'isoprotérénol sont injectés simultanément avec un système fluidique intégré et les réponses des cellules sont surveillés pendant 15 min. Le dosage peut être effectué avec des PBMC fraîches ou congelées et la procédure est terminée en moins de 4 jours.
La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale de cause inconnue généralement définie comme une courbure latérale est supérieure à 10 degrés accompagnés d'une rotation vertébrale 1. La maladie affecte 4% de la population pédiatrique et est le plus souvent diagnostiquée entre l'âge de 9 à 13 ans 2,3,4. Le diagnostic est principalement de l'exclusion et se fait uniquement après avoir écarté les autres causes de déformation de la colonne vertébrale tels que malformation, neuromusculaire ou de troubles syndromiques. Traditionnellement, l'asymétrie trunkal est révélée par Adams essai flexion vers l'avant et mesurée avec scoliomètre lors de l'examen physique 5. Le diagnostic peut être confirmé par observation radiographique de la courbe et de la mesure d'angle selon la méthode de Cobb 6.
Une fois diagnostiquée, la principale préoccupation pour les médecins en charge des enfants scoliotiques est de savoir si la courbe va progresser. En effet, la progression de la courbe est souvent imprévisible etest observée chez les filles plus souvent que chez les garçons 7. Si non traitée, la courbe peut progresser de façon spectaculaire, créant une déformation physique importante et même des problèmes cardio-pulmonaires. Ces manifestations deviennent mortelles quand la courbe dépasse 70 ° 8,9. Les options actuelles de traitement pour prévenir ou arrêter la progression de la courbe comprennent contreventement et la chirurgie. En général, contreventement est recommandé pour les courbes entre 25-40 °, tandis que la chirurgie est réservée aux courbes de plus de 45 ° ou qui ne répondent pas à contreventement.
Environ 10% des enfants diagnostiqués avec une scoliose idiopathique ont la progression de la courbe nécessitant une intervention chirurgicale corrective 10. Actuellement, il n'existe pas de méthode ou de test disponible pour identifier cette catégorie de patients éprouvée. Par conséquent, tous les enfants diagnostiqués sont soumis à de multiples radiographies sur plusieurs années, habituellement jusqu'à ce qu'ils atteignent la maturité du squelette. On estime que les patients typiques atteints de scoliose devrontenviron 22 examens radiologiques sur une période de 3 ans 11. En raison du risque potentiel de multiples examens radiographiques, les approches alternatives qui pourraient permettre l'exécution du pronostic de la scoliose idiopathique sans exposer les enfants à des rayonnements ionisants sont fortement souhaitable. Avec l'intention de répondre à ce besoin, nous avons déjà mis au point un test de dépistage à base de cellules d'un test pronostique pour identifier tôt les enfants asymptomatiques à risque de développer une scoliose idiopathique. Le test prédit les résultats cliniques chez les enfants asymptomatiques et touchés par l'examen de l'état fonctionnel des protéines Gi et classer les enfants en trois groupes fonctionnels (FG1, FG2 et GR3) selon le degré de réponse maximale à la stimulation de la protéine Gi 12, telle que mesurée par la CDS Système à base d'. Ce système est largement utilisé pour évaluer la transduction des signaux des protéines G par le biais de divers types de cellules 13,14,15,16. Il donne des informations sur laréponse intégrée totale des cellules à des stimuli externes, en mesurant les changements dans l'impédance suite à l'activation des récepteurs de la surface cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans des microplaques contenant des électrodes au fond des puits et le système applique une petite tension qui induisent des courants extracellulaires et transcellulaire. À la suite de l'injection du composé dans le puits, les récepteurs de surface des cellules sont stimulées et des événements de transduction de signal se produisent, ce qui conduit à des changements cellulaires qui affectent la circulation de courants extracellulaires et transcellulaire, et affecter de ce fait la grandeur mesurée. Avec cette approche, les patients et les enfants scoliotiques plus à risque de développer une scoliose sont moins sensibles à la stimulation de la protéine Gi par rapport aux sujets témoins sains, et le classement est basé sur le pourcentage de taux de réduction par rapport au groupe témoin. Les gammes de classification sont fixés entre 10 et 40% pour FG3, 40 et 60% pour FG2, et 60 et 90% pour FG1 12.
<p class = "jove_content"> Plus récemment, nous avons modifié cette approche en démontrant que les trois groupes fonctionnels peuvent être clairement distingués en fonction du profil de déséquilibre entre la réponse à Gi et Gs stimulation. En effet, nous avons constaté que la réponse à la stimulation Gi prédominait dans GR3, alors qu'aucun déséquilibre apparent a été observée dans FG2. En revanche, FG1 exposé prédominance de la réponse à la stimulation Gs. En outre, nous avons fourni la preuve que les patients appartenant à FG2 sont plus à risque de progression vers le point d'avoir besoin d'une intervention chirurgicale 17. La précision de ce test de classification a encore été amélioré par la démonstration d'un effet différentiel de l'ostéopontine (OPN) sur la réponse à la stimulation Gi entre les groupes fonctionnels.Ici, nous documentons les étapes détaillées de procédures expérimentales et analytiques de ce test fonctionnel a effectué dans notre laboratoire.
Nous avons décrit une procédure détaillée d'un essai à base de cellules de pronostic pour la scoliose idiopathique qui est applicable à des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) fraîchement isolées ou conservé congelé pendant jusqu'à un an dans de l'azote liquide. Depuis l'utilisation de PBMC fraîchement isolés est lourd lors de l'essai grand nombre de personnes, la procédure a été présenté avec des PBMC congelés qui offrent une alternative plus pratique en milieu clinique. Cependant, des problèmes avec la cellule agglutination lors de la décongélation ont été rencontrées lors de PBMC congelés ont été initialement utilisées, conduisant parfois à la variabilité inter-essai. Pour maximiser la reproductibilité test, nous recommandons d'éviter cycle gel-dégel et à l'aide de l'échantillon congelé une seule fois. La procédure est très simple, ce qui permet une détection précise de la fonction des protéines Gi défectueux dans un court laps de temps. En utilisant cette procédure, les enfants asymptomatiques et scoliotique peuvent être facilement classés de mieux prévoir l'issue clinique sans danger pour leur santé. HoWever, lors de l'exécution classification selon le degré de réponse maximum de Gi stimulation par rapport aux sujets témoins sains 12, plusieurs exigences pour les sujets de contrôle devrait être atteint. En effet, afin d'avoir une cohorte de comparaison approprié, les sujets de contrôle doivent être âge et le sexe identifié, pas sur tout type de médicaments, et de fournir des renseignements personnels, tels que les antécédents médicaux particuliers / familiale. Ces exigences ne peuvent constituer un obstacle important pour le recrutement des sujets témoins. Par conséquent, effectuer une classification en examinant le degré de déséquilibre entre la réponse à Gs et Gi stimulation de la protéine chez le même individu est idéale pour éliminer la nécessité d'utiliser des sujets témoins.
L'utilisation du système basé sur le CDS pour effectuer ce test pronostique est importante en termes de fournir simultanément Gi-réponses cellulaires et Gs médiation dans le même essai. Bien que de nombreux patients peuvent être classés sans hambiguïté en utilisant la gamme dynamique fixe pour ce test, un petit nombre de patients présentent des valeurs à la limite de gammes, comme illustré par les résultats du présent rapport. Pour distinguer ces personnes, nous avons introduit l'évaluation de l'effet de l'OPN sur la réponse à la stimulation Gi en démontrant que OPN induit un effet différentiel sur la réponse cellulaire Gi-médiation entre les trois groupes fonctionnels. En effet, nous avons constaté que, en présence de l'OPN, réponse à Gi stimulation augmente dans FG1, tandis qu'elle diminue dans GR2 GR3 et, dans une plus large mesure dans FG2. Malgré le coût élevé de l'OPN, l'utilisation de cette chimiokine est essentiel de distinguer les cas ambigus, et donc d'améliorer la précision de notre essai de classification. Toutefois, ce dosage présente un inconvénient en ce que un minimum de 1,5 x 10 5 cellules par puits est nécessaire pour observer la réponse cellulaire avec le système à base de CDS dans nos conditions expérimentales. Certains échantillons de patients n'auront pas un nombre suffisant deles cellules à tester. Dans ce cas, il est nécessaire de rappeler les patients pour la collecte de sang supplémentaire, qui peut être inquiétant pour les familles et frustrant pour le personnel médical et de laboratoire. Des études prospectives sont prévues dans notre laboratoire pour résoudre ce problème.
Néanmoins, le protocole actuel repose sur des méthodes simples et éprouvées pour préparer des cellules alors que le test est automatisé en utilisant un système validé sans étiquette 13, 14 pour surveiller les réponses des cellules. La plate-forme de test est relativement peu coûteux par rapport à la plate-forme génétique disponible pour le pronostic d'autres maladies. En outre, le coût de tous les matériaux jetables, y compris les tubes de collecte de sang, des conseils, l'électrode spéciale microplaques, et conique et tubes Eppendorf, n'est pas très cher et est estimée à moins de 3000 $ pour effectuer un test pour environ un millier de patients. Bien que cette estimation ne comprend pas les coûts de main-d'œuvre pour la préparation d'échantillonset la réalisation du test, ce test reste beaucoup plus abordable que les plates-formes de séquençage de nouvelle génération. Il convient de noter, c'est non seulement la comparaison des coûts de plates-formes génétiques, mais plus spécifiquement liées au domaine de l'AIS, ce sont les coûts associés à l'imagerie radiologique. Aujourd'hui, plus d'un million d'enfants aux Etats-Unis et environ 100 000 enfants au Canada reçoivent un diagnostic de la scoliose idiopathique, et le coût total du diagnostic et le suivi des enfants scoliotiques par exposition aux rayons X est plus de 2,5 milliards de dollars par an en Amérique du Nord. Ainsi, on s'attend à notre procédure de test à base de cellules pour être adapté pour le dépistage et le suivi des enfants atteints de scoliose idiopathique sans risque pour la santé et à moindre coût routine.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, France (au Dr Moreau), les Instituts de recherche en santé du Canada (Grant PP2-99466 Dr Moreau) et de quatrième dimension Spine LLC , New York, États-Unis (Bourse de recherche au Dr Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |