ويرد البروتوكول المنظم لفحص خلية مقرها بمثابة اختبار وظيفي للتنبؤ والتكهن الجنف مجهول السبب باستخدام التحليل الطيفي عازلة الخلوية (CDS). الفحص لا يمكن أن يؤديها مع خلايا الدم المحيطية الطازجة أو المجمدة (PBMCs) واكتمال الإجراء في غضون 4 أيام.
تفاصيل هذا البروتوكول الإجراء التجريبية والتحليلية لفحص خلية مقرها وضعت في المختبر لدينا بمثابة اختبار وظيفي للتنبؤ والتكهن الجنف مجهول السبب عند الأطفال أعراض والمتضررة. يتكون الاختبار من تقييم الحالة الوظيفية للغي وع البروتينات في الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من خلال التحليل الطيفي عازلة الخلوية (CDS)، وذلك باستخدام أداة التلقائية وفقا CDS-، وتصنيف الأطفال إلى ثلاث مجموعات وظيفية (FG1 ، FG2، FG3) فيما يتعلق الشخصى التوازن بين درجة استجابة لغي وع البروتينات التحفيز. تأكيد التصنيف مزيد من التأثير المتباين للosteopontin (OPN) على الاستجابة لتحفيز غي بين الجماعات والمشار إليها تطور شديد من المرض عن طريق FG2. تقريبا، لا بد من حجم 10 مل من الدم لاستخراج PBMCs بواسطة Ficoll-الانحدار والخلايا ثم يتم تخزينها في النيتروجين السائل. عدد كاف من Pيتم الحصول على خلايا نخاع العظم لأداء الفحص بعد يومين من زراعة الخلايا. أساسا، يتم تحضين الخلايا الأولى مع phytohemmaglutinin (فا). بعد 24 ساعة الحضانة، يتم استبدال المتوسطة من قبل مستنبت خالية من PHA ل24 ساعة إضافية قبل البذر الخلية والعلاج OPN. ثم يتم فحص الخلايا الطيفي لردودها على السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول، التي تنشط على التوالي غي وع البروتينات من خلال مستقبلاتها وما شابه ذلك. يتم حقن كل من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول في وقت واحد مع نظام FLUIDICS متكاملة وتتم مراقبة ردود الخلايا لمدة 15 دقيقة. الفحص لا يمكن أن يؤديها مع PBMCs الطازجة أو المجمدة واكتمال الإجراء في غضون 4 أيام.
الجنف مجهول السبب هو تشوه العمود الفقري لسبب غير معروف تعرف عموما بأنها انحناء الجانبي أكبر من 10 درجة مصحوبة التناوب الفقري 1. يؤثر على حالة 4٪ من السكان ويتم تشخيص الأطفال الأكثر شيوعا بين سن 9 إلى 13 عاما 2،3،4. التشخيص هو في المقام الأول من الإقصاء ويتم فقط بعد استبعاد الأسباب الأخرى للتشوه في العمود الفقري مثل تشوه العمود الفقري، أو اضطرابات العصبية والعضلية المتلازمات. تقليديا، تبين عدم التماثل trunkal من قبل آدمز اختبار الانحناء إلى الأمام، ويقاس مع مقياس الجنف خلال الفحص البدني 5. ويمكن بعد ذلك يتم تأكيد التشخيص عن طريق التصوير الشعاعي للمراقبة من منحنى وقياس زاوية باستخدام طريقة كوب 6.
مرة واحدة تم تشخيصها، الشغل الشاغل للأطباء في إدارة الأطفال جنفي هو ما إذا كان منحنى سوف تقدم. في الواقع، وتطور منحنى لا يمكن التنبؤ بها في كثير من الأحيان وهو لوحظ بين الفتيات بشكل متكرر أكثر من الفتيان في 7. إذا لم يعالج، يمكن أن منحنى التقدم بشكل كبير، وخلق تشوهات جسدية كبيرة ومشاكل القلب حتى. هذه المظاهر أصبحت تهدد الحياة عندما يتجاوز منحنى 70 درجة 8،9. وتشمل خيارات العلاج الحالية لمنع أو وقف تطور منحنى تستعد والجراحة. بشكل عام، ينصح تستعد لمنحنيات بين 25-40 درجة مئوية، في حين تم حجز جراحة لمنحنيات أكبر من 45 درجة أو لا تستجيب لتستعد.
حوالي 10٪ من الأطفال تشخيص الجنف مجهول السبب يكون تطور منحنى تتطلب جراحة تصحيحية 10. حاليا، لا توجد طريقة مؤكدة أو اختبار متاح لتحديد هذه الفئة من المرضى. بالتالي، يتعرض جميع الأطفال لتشخيص الصور الشعاعية متعددة على مدى عدة سنوات، وعادة حتى تصل إلى مرحلة النضج الهيكل العظمي. وتشير التقديرات إلى أن المرضى نموذجية مع جنف سيكون لهاما يقرب من 22 الفحوصات الإشعاعية على مدى فترة 3 سنوات 11. بسبب الخطر المحتمل من الامتحانات التصوير الشعاعي متعددة، والنهج البديلة التي يمكن أن تسمح بأداء تشخيص الجنف مجهول السبب دون تعريض الأطفال للإشعاع المؤين تكون مرغوبة بشدة. بهدف تلبية هذه الحاجة، وقد وضعنا سابقا الفحص فحص خلية مقرها كاختبار النذير لتحديد عاجلا الأطفال المعرضين للخطر أعراض الجنف مجهول السبب من تطوير. ويتوقع اختبار نتائج السريرية في كل من الأطفال أعراض وتتأثر دراسة الوضع الوظيفي للبروتينات غي وتصنيف الأطفال إلى ثلاث مجموعات وظيفية (FG1، FG2 وFG3) وفقا لدرجة الحد الأقصى ردا على البروتين غي التحفيز 12 مقاسا CDS نظام قائم. ويستخدم هذا النظام إلى حد كبير لتقييم نقل الإشارة من خلال البروتينات G في مختلف أنواع الخلايا 13،14،15،16. انه يعطي معلومات عن مجموعه متكاملة من استجابة الخلايا للمؤثرات الخارجية من خلال قياس التغيرات في مقاومة بعد تنشيط مستقبلات سطح الخلية. هي المصنفة الخلايا في microplates التي تحتوي على أقطاب كهربائية في الجزء السفلي من الآبار ويطبق نظام الجهد الصغيرة التي تحفز التيارات خارج الخلية والعابر للخلايا. بعد حقن المركب في البئر، يتم تحفيز مستقبلات سطح الخلية وتحدث الأحداث نقل الإشارة، مما يؤدي إلى التغيرات الخلوية التي تؤثر على تدفق تيارات خارج الخلية والعابر للخلايا، وبالتالي تؤثر على حجم قياسه. مع هذا النهج، والمرضى والأطفال جنفي أكثر عرضة لخطر تطوير جنف هي أقل استجابة لغي تحفيز البروتين مقارنة مع الضابطة صحية، ويستند التصنيف على نسبة الدرجة من انخفاض نسبي للسيطرة على المجموعة. يتم إصلاح النطاقات تصنيف بين 10 و 40٪ لFG3 و 40 و 60٪ لFG2، و 60، و 90٪ للFG1 12.
<p claق ق = "jove_content"> وفي الآونة الأخيرة، قمنا بتعديل هذا النهج من خلال إظهار أن المجموعات الوظيفية الثلاثة يمكن تمييزها بوضوح وفقا لمحة من عدم التوازن بين الاستجابة لغي والتحفيز ع. في الواقع، وجدنا أن الاستجابة لتحفيز غي سادت في FG3، في حين لم يلاحظ أي خلل واضح في FG2. في المقابل، أظهرت FG1 غلبة للاستجابة لتحفيز ع. بالإضافة إلى ذلك، قدمنا أدلة على أن المرضى الذين ينتمون إلى FG2 هي أكثر عرضة للخطر من يتقدم إلى نقطة تحتاج إلى عملية جراحية 17. وكذلك تم تحسين دقة هذا الاختبار تصنيف من خلال إظهار تأثير الفرق من osteopontin (OPN) على الاستجابة لتحفيز غي بين المجموعات الوظيفية.نحن هنا توثيق خطوات تفصيلية من الإجراءات التجريبية والتحليلية لهذا الاختبار وظيفية يؤديها حاليا في مختبرنا.
وصفناها إجراء مفصل لاختبار خلية مقرها النذير لجنف مجهول السبب أن ينطبق على خلايا الدم المحيطية (PBMCs) معزولة طازجة أو مجمدة حفظها لمدة تصل إلى واحد في النيتروجين السائل. منذ استخدام PBMCs المعزولة حديثا مرهقة عند اختبار عدد كبير من الأفراد، وقدم الإجراء مع PBMCs المجمدة التي توفر بديلا أكثر عملية في إعداد سريرية. ومع ذلك، ووجهت مشاكل مع التثاقل الخلية على الذوبان عندما استخدمت في البداية PBMCs المجمدة، مما يؤدي في بعض الأحيان إلى تقلب بين الفحص. لتعظيم فحص استنساخ، نوصي بتجنب دورة تجميد ذوبان الجليد وباستخدام عينة مجمدة مرة واحدة فقط. هذا الإجراء هو بسيط جدا، والسماح لكشف دقيق للخلل وظيفة البروتين غي في وقت قصير. باستخدام هذا الإجراء، والأطفال أعراض وجنفي يمكن تصنيفها بسهولة للتنبؤ أفضل النتائج السريرية من دون أي خطر على صحتهم. حويفر، عند تنفيذ التصنيف وفقا لدرجة الحد الأقصى ردا على التحفيز غي نسبة إلى الضابطة الصحية 12، يجب أن تتحقق متطلبات عدة لالضابطة. في الواقع، من أجل أن يكون لفيف مقارنة صحيحة، يجب أن تكون الضابطة العمر والجنس المتطابقة، لا يكون على أي نوع من الدواء، وتوفير المعلومات الخاصة، مثل الفرد / التاريخ الطبي العائلي الماضية. قد تشكل هذه المتطلبات عقبة هامة لتوظيف الضابطة. لذلك، من خلال دراسة أداء تصنيف درجة من عدم التوازن بين الاستجابة لغي وع البروتين التحفيز في نفس الفرد هو المثل الأعلى للقضاء على ضرورة استخدام الضابطة.
استخدام نظام يستند CDS-لأداء هذا الاختبار النذير مهم من حيث توفير وقت واحد غي والاستجابات الخلوية ع بوساطة في نفس الفحص. على الرغم من أن العديد من المرضى يمكن أن تصنف مع عدم وجود صباحاbiguity باستخدام مجموعة ديناميكية ثابتة لهذا الاختبار، وعدد قليل من المرضى سوف يحمل القيم على الشريط الحدودي من النطاقات، كما يتضح من نتائج هذا التقرير. لتميز هؤلاء الأفراد، أدخلنا تقييم تأثير OPN على الاستجابة لتحفيز غي من خلال إظهار أن OPN يؤدي الى التأثير المتفاوت على الاستجابة الخلوية غي بوساطة بين المجموعات الوظيفية الثلاث. في الواقع، وجدنا أن في وجود OPN، استجابة لزيادة التحفيز غي في FG1، في حين أنه يقلل في FG2 وFG3، إلى أعلى حد في FG2. على الرغم من التكلفة العالية لOPN، واستخدام هذا chemokine الضروري أن نميز الحالات الغامضة، وبالتالي تحسين دقة الفحص تصنيف لدينا. ومع ذلك، هذا الاختبار لديه عيب في أن هناك حاجة إلى الحد الأدنى من 1.5 × 10 5 خلايا لكل بئر لمراقبة استجابة الخلوية مع نظام يقوم CDS-تحت ظروف تجريبية لدينا. سوف عينات المرضى معينة ليس لديها عدد كاف منخلايا لفحصها. في هذه الحالة، من الضروري أن نذكر المرضى لجمع الدم إضافية، والتي يمكن أن تكون مثيرة للقلق للأسر ومحبطة لأفراد الطواقم الطبية والمختبرية. ومن المقرر الدراسات المستقبلية في مختبرنا لمعالجة هذه المسألة.
ومع ذلك، يعتمد البروتوكول الحالي على طرق بسيطة ومجربة لإعداد الخلايا بينما يتم اختبار الآلي باستخدام نظام التسمية خالية من التحقق من صحة 13 و 14 لرصد الاستجابات للخلايا. منصة الاختبار غير مكلفة نسبيا بالمقارنة مع منصة الجينية المتاحة لتشخيص أمراض أخرى. أيضا، فإن تكلفة جميع المواد القابل للتصرف، بما في ذلك أنابيب جمع الدم، نصائح، القطب خاصة microplates، والمخروطية وأنابيب إيبندورف، ليست مكلفة جدا ويقدر بأقل من 3،000 دولار لإكمال اختبار ما يقرب من ألف مريض. على الرغم من هذا التقدير لا يشمل تكاليف اليد العاملة لإعداد العيناتوأداء الاختبار، لا يزال هذا الاختبار إلى حد كبير أكثر يسرا من الجيل المقبل من منصات التسلسل. الجدير بالذكر، ليس فقط مقارنة التكاليف لمنصات الوراثية، ولكن أكثر تتعلق مجال AIS على وجه التحديد، هي التكاليف المرتبطة إلى التصوير الإشعاعي. اليوم، يتم تشخيص أكثر من مليون طفل في الولايات المتحدة وحوالي 100،000 طفل في كندا مع الجنف مجهول السبب، والتكلفة الإجمالية للتشخيص ورصد الأطفال جنفي عن التعرض للأشعة السينية هي أكثر من 2.5 مليار دولار سنويا في أمريكا الشمالية. وبالتالي، من المتوقع أن تكون مناسبة للتفتيش الروتيني ومراقبة الأطفال الذين يعانون من الجنف مجهول السبب دون مخاطر صحية وبتكلفة أقل لدينا إجراء فحص خلية مقرها.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة إيف لا Cotrel DE L'معهد فرنسا، باريس، فرنسا (للدكتور مورو)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (منح PP2-99466 للدكتور مورو) والرابعة من العمود الفقري البعد LLC ، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية (منحة أبحاث للدكتور مورو).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |