Werkwijze voor de synthese van lucht-gevoelige titaan en vanadium antikankermiddelen wordt beschreven, samen met de evaluatie van hun cytotoxische activiteit voor humane kankercellijn de MTT assay.
Titaan (IV) en vanadium (V)-complexen zeer krachtige anti-kanker middelen. Een uitdaging in hun synthese verwijst naar hun hydrolytische instabiliteit derhalve hun bereiding onder een inerte atmosfeer uitgevoerd. Evaluatie van de antikanker activiteit van deze complexen kunnen worden bereikt door de MTT-bepaling.
De MTT test is een colorimetrische levensvatbaarheid-assay gebaseerd op enzymatische reductie van MTT tot formazan molecuul wanneer het wordt blootgesteld aan levensvatbare cellen. Het resultaat van de reductie is een kleurverandering van de MTT molecuul. Absorptiemetingen opzichte van een controle bepalen percentage resterende levensvatbare kankercellen na de behandeling met verschillende concentraties van de geteste verbinding, die wordt omgezet naar de verbinding antikanker activiteit en de IC50-waarden. De MTT-test is algemeen gebruikelijk in cytotoxiciteit studies vanwege zijn nauwkeurigheid, snelheid en relatieve eenvoud.
Hierin hebben we pregaf een gedetailleerd protocol voor de synthese van lucht gevoelige metaal gebaseerde geneesmiddelen en cellevensvatbaarheid metingen, inclusief voorbereiding van de celplaten, incubatie van de verbindingen met de cellen, de levensvatbaarheid met de MTT-bepaling en de bepaling van IC50-waarden.
Chemotherapie is nog steeds een van de belangrijkste reeksen behandelingen die in de kliniek voor diverse kanker ziekten, en dus enorme hoeveelheid onderzoek is wereldwijd uitgevoerd teneinde nieuwe en verbeterde geneesmiddelen tegen kanker te ontwikkelen. Dergelijke studies meestal beginnen op chemisch niveau, met het ontwerp en de bereiding van verbindingen, gevolgd door biologische evaluatie van de cytotoxische eigenschappen in vitro. Levensvatbaarheid van de cellen kan worden beoordeeld door de verschillende testen die informatie over de cellulaire activiteit 1-2 bieden.
Cisplatine is een voorbeeld van een platina complex dat veel gebruikt wordt als een chemotherapeutisch middel, dat wordt beschouwd als een efficiënte behandeling voornamelijk testis en ovarium 3-4. Echter, de smalle activiteit bereik en ernstige bijwerkingen veroorzaken studies van andere krachtige overgangsmetaalcomplexen 5-8. Onder andere, titaan (IV) en vanadium (V)-complexen waren veelbelovend hoogactieve en verminderdetoxiciteit 9-16. Ti (IV)-complexen werden de eerste klinische fase te starten na cisplatine vanwege deze eigenschappen, maar hebben ze niet de onderzoeken vanwege formulering moeilijkheden en hydrolytische instabiliteit. Er is dus een huidige behoefte aan verbeterde derivaten van deze metaalcomplexen die hoge antikanker activiteit kan combineren met waterbestendigheid 15,17-21 ontwikkelen.
Een uitdaging bij de bereiding van Ti (IV) en V (V) complexen betrekking op de hydrolytische instabiliteit van de precursor reagentia en derhalve dient inerte atmosfeer gehandhaafd. De bereiding van Ti (IV) en V (V) verbindingen wordt uitgevoerd onder N2 of Ar omstandigheden in een zuurkast of via Schlenk lijn-technieken.
Een gemeenschappelijke methode voor het evalueren van de activiteit tegen kanker is het MTT (3 – (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay. Deze test is een colorimetrische test die de levensvatbaarheid in 1983 door Mosmann22. Het is zeer goed bestudeerd en gekarakteriseerd, en het wordt beschouwd als zeer efficiënt bij de beoordeling van de effectiviteit van nieuwe cytotoxische verbindingen vanwege zijn precisie, snelheid en zijn vermogen aan te brengen op diverse cellijnen. De levensvatbaarheid assay is gebaseerd op de kleurverandering van de MTT molecuul wanneer het wordt blootgesteld aan levensvatbare cellen. Meting van de absorptie, die evenredig is met het aantal levensvatbare cellen, en vergelijking met onbehandelde controles, maakt beoordeling van de celgroei remming mogelijkheden van de geteste verbinding.
De MTT-colorimetrische test wordt uitgevoerd in een 96-putjes 23. De cellen kunnen voorincubatie in de putjes voor de toevoeging van het geteste geneesmiddel vereisen. De pre-incubatie kunnen variëren 0-24 uur afhankelijk van de cellijn eigenschappen. Cellen worden gewoonlijk blootgesteld aan het geneesmiddel 24-96 uur afhankelijk van de drugactiviteit. MTT oplossing wordt vervolgens toegevoegd aan de behandelde cellen, waarbij de schreeuwenow MTT paars formazan verminderd verschillende mitochondriale en cytosolische enzymen die operationeel in levensvatbare cellen (figuur 1) 24 zijn. De MTT molecuul wordt niet verminderd door dode cellen of rode bloedcellen (metabolisch inactieve cellen), miltcellen (rustende cellen) en concanavaline-A gestimuleerde lymfocyten (geactiveerde cellen) 22. Na 3-4 uur incubatie met MTT de formazan precipitaten. De vorming van formazan begint na 0,5 uur incubatie maar voor een optimaal resultaat is het het beste om de cellen bloot te MTT tenminste 3 uur 22. Bijgevolg wordt het groeimedium verwijderd en de formazan wordt opgelost in een organisch oplosmiddel, bij voorkeur isopropanol 25, hoewel DMSO kan worden gebruikt 26. De eliminatie van het medium is cruciaal om nauwkeurige resultaten omdat fenolrood, die op grote schaal voor in groeimedium en neerslaan eiwitten kunnen interfereren met de absorptie meting 25. Wanneer de formazan oplossing bereikt homogeen, de extinctie van de oplossing wordt gemeten met een spectrofotometer microplaat lezer. De absorptie bij 550 nm is recht evenredig met het aantal cellen in het bereik van 200-50,000 cellen per putje, en dus zeer kleine hoeveelheden cellen kan worden gedetecteerd 22. De absorptie geeft de hoeveelheid levensvatbare cellen die overblijven na behandeling met het geneesmiddel, en vergeleken met de absorptie van controlecellen die niet werden blootgesteld aan het geneesmiddel. Analyse van de resultaten op juiste software geeft de IC50 (inhibitie concentratie 50%) waarden en hun statistische fouten gebaseerd op verschillende herhalingen van de meting.
De MTT test is algemeen gebruikelijk in cytotoxiciteit studies voor het screenen van nieuwe anti-kanker verbindingen, vanwege zijn relatieve eenvoud en nauwkeurigheid. Wanneer echter de MTT assay, die afhankelijk enzymatische reactie moet men overwegen dat verschillende remmers opstelling kan de reductie van MTT eend leiden tot verkeerde resultaten 27. Bovendien is de MTT-bepaling geen enkele informatie over het moleculaire mechanisme van de cytotoxische activiteit van het geneesmiddel 2.
De methode combineert dit manuscript beschreven chemische synthese met biologische cellevensvatbaarheid assay. Zoals bij elke biologische methoden betreffende levensvatbare cellen, is het essentieel om te werken in een laminaire kap en onderhouden steriele omstandigheden, inclusief het gebruik van steriele organische oplosmiddelen. Ook, bereiding en opslag van instabiel voor hydrolyse metaal gebaseerde geneesmiddelen moeten worden uitgevoerd onder inerte omstandigheden, waarvoor handschoenenkastje of Schlenk lijn techni…
The authors have nothing to disclose.
De financiering werd onder het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (FP7/2007-2013) ontvangen van de European Research Council / ERC Grant overeenkomst geen [239603]
Reagent/Material | |||
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
Equipment | |||
12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
Eppendorf vial | KARTELL | ||
Glove box | M. Braun | ||
Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
Pipette 5-50 μl | Finnpipette |