MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물
Summary
공기에 민감한 티탄 및 바나듐 항암제의 합성 방법은 MTT 분석에 의해 인간의 암 세포주를 향해 자신의 세포 상해 활성의 평가와 함께 설명한다.
Abstract
티타늄 (IV) 및 바나듐 (V) 착물은 매우 강력한 항암제이다. 자신의 합성 문제는 자신의 가수 분해 불안정을 의미하므로 자신의 준비는 불활성 분위기 하에서 수행되어야한다. 이러한 복합체의 항암 활성의 평가는 MTT 분석에 의해 달성 될 수있다.
MTT 분석은 그것이 가능한 세포에 노출되었을 때 MTT 포마 잔하는 분자의 환원 효소에 기반 비색 생존력 분석법이다. 환원의 결과는 MTT 분자의 색 변화이다. 컨트롤을 기준으로 흡광도 측정은 복합 항암 활성 및 IC 50 값으로 변환하는 테스트 화합물의 농도 변화와의 다음과 같은 치료 가능한 암 세포를 나머지의 비율을 결정합니다. MTT 분석은 정확성, 신속성, 그리고 상대적으로 단순에 의한 세포 독성 연구에서 널리 일반적입니다.
여기에서 우리는 사전셀 플레이트의 제조, 세포와 화합물의 배양 등 공기에 민감한 금속 기반 약물 및 세포 생존 능력 측정의 합성에 대한 상세한 프로토콜을 전송, MTT 분석하고 IC 50 값의 판정을 사용하여 생존력을 측정.
Introduction
화학 요법은 여전히 다양한 암 질환의 임상 치료에 사용의 주된 과정 중 하나이며, 따라서 연구의 방대한 양의 새롭고 개선 된 항암제를 개발하는 것을 목표로 세계적으로 수행된다. 이러한 연구는 주로 시험 관내 세포 독성 특성의 생물학적 평가에이어서 화합물의 설계 및 제조와, 화학적 레벨에서 시작한다. 세포 생존 능력은 세포 활동 1-2에 대한 정보를 제공하는 다양한 분석에 의해 평가 될 수있다.
시스플라틴은 광범위 정소 및 난소 암 3-4 주로 효율적인 치료 간주 화학 치료 약물로 사용되는 백금 착물의 예이다. 그러나, 좁은 활성 범위 및 심각한 부작용은 다른 유력한 전이 금속 착체 5-8의 연구 결과를 발생시킨다. 다른 사람의 사이에서, 티타늄 (IV) 및 바나듐 (V) 단지는 높은 활동의 유망한 결과를 보여 주었다 감소독성 9-16. 티타늄 (IV) 컴플렉스 때문에 이러한 속성에 시스플라틴 후 임상 시험을 입력하는 첫번째이었다, 그러나, 그들은 인해 배합 어려움과 가수 불안정 시험을 실패했습니다. 내수성 15,17-21 높은 항암 활성을 결합 할 수있는 금속 착체의 개선 된 유도체를 개발하기 위해 현재 필요하므로있다.
티타늄 (IV) 및 V의 제조에 도전 (V) 착물 전구체 시약의 가수 불안정성을 의미하므로, 불활성 분위기가 유지되어야한다. 티타늄 (IV) 및 V (V) 화합물의 제조는 글로브 박스 또는 쉬 렝크 라인 기술을 사용하여 N 2 또는 아르곤 조건 하에서 수행된다.
분석 – 항암 활성의 평가를위한 하나의 일반적인 방법은 MTT ((4,5 – dimethylthiazolyl) -2,5 – 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 3)에 기초한다. 이 분석은 Mosmann에 의해 1983 년에 발표 된 비색 생존 분석입니다22. 그것은 매우 잘 연구되고 특징으로 인해 정밀도, 신속성 및 세포주의 다양한 적용되는 그 기능에 새로운 세포 독성 화합물의 효과를 평가할 때, 그것은 매우 효율적으로 간주된다. 이 생존력 분석은 그것이 가능한 세포에 노출 MTT 분자의 색상 변화에 근거한다. 생존 세포의 수에 비례하여 흡광도, 및 미처리 컨트롤과 비교하여 측정은, 시험 된 화합물의 세포 성장 억제 능력의 평가를 가능하게한다.
MTT 비색 분석은 96 – 웰 플레이트 포맷 (23)에서 수행된다. 세포는 시험 약물을 추가하기 전에 우물에서 예비 배양을 필요로 할 수있다. 예비 배양 시간은 세포주의 특성에 따라 0-24 시간과 다를 수 있습니다. 셀은 일반적으로 약물 활동에 따라 24-96 시간 동안 약물에 노출된다. MTT 용액을 엘 처리 된 세포에 첨가된다오우 MTT (그림 1) (24) 실행 가능한 세포에서 운영되어 미토콘드리아와 세포질 다양한 효소에 의해 보라색 포르 마잔로 감소된다. MTT 분자는 죽은 세포 또는 적혈구 (대사 비활성 셀), 비장 세포 (휴식 세포)와 콘 카나 발린 A를 자극 림프구 (활성화 된 세포) (22)에 의해 감소되지 않습니다. MTT 포마 침전물과 배양 3 ~ 4 시간 후. 포르 마잔의 형성은 배양 0.5 시간 후 시작하지만, 최적의 결과를 위해 적어도 3 시간 (22) MTT에 세포를 노출하는 것이 가장 좋습니다. 따라서, 성장 배지를 제거하고 DMSO도 26을 사용할 수 있지만 포르 마잔은, 유기 용매, 바람직하게는 이소프로판올 (25)에 용해된다. 매체의 제거는 성장 배지에서 널리 일반적인 페놀 레드, 이후 정확한 결과를 달성하고, 단백질은 흡광도 측정 (25)을 방해 할 수 석출 위해 결정적이다. 때 견적잔 용액 용액의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더 분광 광도계를 사용하여 측정되고, 균질 도달한다. 550 nm에서의 흡광도는 웰 당 200-50,000 셀 범위의 셀의 개수에 비례하고, 따라서 셀의 매우 작은 양 (22)을 검출 할 수있다. 흡광도는 약물 치료 후에 남아 생존 세포의 양을 나타내며, 약물에 노출되지 않은 대조군 세포의 흡광도와 비교된다. 적절한 소프트웨어에 의해 결과의 분석은 IC 50 (억제 농도, 50 %) 제공 값과 통계적 오차 측정의 몇몇 반복에 따라.
MTT 분석은 정확성과 단순함으로 인해 새로운 항암 화합물을 스크리닝 세포 독성 연구에서 널리 일반적입니다. 효소 반응에 의존 MTT 분석법을 사용한 경우에는, 하나는 각종 효소 저해제는 MTT의 감소에 영향을 미칠 수 있다는 것을 참고해야false 결과 27로 이어질 거라고. 또, MTT 분석법은 약물 2의 세포 상해 활성의 기전에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않는다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에 기재된 방법은 생물학적 세포 생존 분석으로 화학 합성을 결합한다. 생존 세포에 관한 생물학적 방법과 마찬가지로 층류 후드에서 작업하고, 멸균 유기 용매의 사용을 포함하여 멸균 조건을 유지하기 위해 필수적이다. 또한, 가수 분해 불안정한 금속 기반 약물의 제조 및 저장되는 글로브 박스 또는 쉬 렝크 라인 기법들이 이용되어야 불활성 조건 하에서 수행되어야한다.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기금은 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에서 유럽 연구위원회에서받은 / ERC 보조금 이용 약관을 더 [239603] 없습니다
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette |
References
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