JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
화학

Hazırlayıcı ince tabaka kromatografisi ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile Bat Örtü Lipidler triasilgliseridler İçeriği profil

Published: September 05, 2013
doi:
10.3791/50757
, ,
1Graduate Program of Environmental Science,Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences,Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology,Arkansas State University

Summary

Memeli integument bireysel türlerin kimyasal bileşimleri özelliği sağlayabilir çözücü-ekstrakte lipidler içerir. Bu çalışma, ince tabaka kromatografisi kullanılarak deriye ait dokulardan izole geniş bir lipit sınıfları ayıran ve matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi ile triasilgliseridler profilini belirlemek için rutin bir yöntem sunar.

Abstract

Memeli zar cilt yüzeyi üzerine yağlı bir madde salgılar yağ bezleri içerir. Sebum üretim patojenik mikroplara karşı koruyucu olan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir parçasıdır. Anormal sebum üretimi ve kimyasal bileşimi ayrıca belirli deri hastalıklarının klinik belirtisi vardır. Sebum türe özgü olduğu triaçilgliseridler, aşağıdakileri içeren lipidler, kompleks bir karışımını içerir. Çeşitli lipit sınıfları tarafından arzedilen geniş kimyasal özellikleri sebum bileşimin spesifik belirlenmesine engeller. Lipidler için analitik teknikler genellikle emek-yoğun ve artış numune hazırlama maliyetleri kimyasal türevlendirilmelerini gerektirir. Bu kağıt, ince-tabaka kromatografisi ile, memeli zarının, ayrı geniş lipid sınıflardan lipidlerin çıkarılmasına ve matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi kullanılarak triasilgliseridler içeriği profil açıklamaktadır. Bu sağlam yöntem, doğrudan belirlenmesini sağlartürleri ve bireyler arasında triasilgliseridler profillerin ve hali hazırda, memelilerde herhangi bir taksonomik grubuna uygulanabilir.

Introduction

Memeli kabukla dokular epidermis, keratin yapılar (örneğin saç ve tırnaklar) ve ekzokrin bezleri vardır. Yağ tipi salgı bezleri toplu Pilosebasöz birimi 1 olarak adlandırılır saç folikülleri, ile ilişkilidir. Yağ bezleri sebum olarak adlandırılan deri yüzeyi üzerine yağlı bir eksüda bırakın. Sebum gliserolipidler (örneğin triasilgliseridler [TAG]), serbest yağ asiller (SYA), sterol / balmumu esterleri, skualen ve büyük ölçüde oluşur. Sebum kimyasal kompozisyonu türe özgü 2'dir. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin parçası olan ve antimikrobiyal fonksiyonu 3. sağlamanın yanı sıra, yağ lipidler cilt 4 yoluyla buharlaşan su kaybı, hücresel bütünlüğü ve gen regülasyonu 5 ve ilaç emilimi 6 olmak üzere önemli fizyolojik süreçleri etkiler. Yağ lipid bileşimleri, aynı zamanda hastalık işaretçileri olarak da hizmet edebilir. Altered oranları ve yağ b miktarlarıyol lipit sınıfları, diğerleri 10 arasında akne vulgaris 7, kepek 8, seboreik dermatit 8, asteatosis 9, gibi hastalıkların klinik belirtileri vardır. Epidermal ve saç dokuları sterol ve türevleri, TAG, SYAleri, seramid, fosfolipid, ve diğer küçük lipid bileşenleri içeren değişken profillerini içerir. Deriye lipitler, hastalık süreçlerinde işlev görebilir çünkü sağlıklı ve hastalıklı bireyler arasında TAG'lerin kimyasal bileşimlerinde farklılıkları belirlemek hastalığının klinik tanısı için faydalı olabilir.

Lipidler, genellikle polar olmayan veya polar olmayan, polar ya da ikame 11 ile suda çözülmeyen organik bileşikler olarak tanımlanır. Lipid yapıların uzun hidrokarbon zinciri, (balmumu esterleri, FFAs, alkoller, ketonlar ve aldehidler de dahil olmak üzere), oksijene alkanlar, ya da kolesterol 12 gibi kompleks halka yapıları olabilir. Yapısına dayalı lipidlerin sekiz ana sınıfları (SYA, glycerolipi vardırds [GL] gliserofosfolipitlerdir bağlı olarak kimyasal özelliklerinin geniş bir yelpazesi sergilerler [GP], sfingolipidler [SP], sterol lipidler [ST], prenol lipidler [PR], saccharolipids [SL] ve poliketidler [PK]) sınıf 13. Nedeniyle lipid sınıflarının kimyasal özellikleri en geniş varyasyon için, lipit moleküllerinin önceden türetme olmadan direk profil arzu edilir. Lipid araştırmalarda ortaya çıkan bir yöntemi, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) 14 ile birlikte, ince-katman kromatografisi (TLC) 'dir.

MALDI-TOF MS proteinleri belirlemek nedeniyle tripsin ile sindirilmiş proteinler 15 üretilen son derece hassas peptid iyon kütle "parmak izi" ile spesifik amino asit dizilerine ilişkilendirmek proteomik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır. MALDI-TOF MS, aynı zamanda, TAG'lerin 16-18 gibi lipitler dahil olmak üzere diğer biyomolekül sınıfları, profil için de kullanılabilir. MALDI bir matris, tip kullanımını gerektirir,aromatik ve konjuge çift bağ yapılarını içeren bir organik bileşik ically. Matris molekülleri yavaşça analitleri için lazerin enerji transferi proton transferini teşvik etmek ve tek yüklü gaz fazı üretmek için iyonları 19-21 vermektedir. İyonlar, yüksek vakum altında yüksek bir voltaj alana maruz kalan ve iyonlar, daha sonra kendi kütle-şarj oranı ile orantılı olan hız farklılıkları ile ayrılmış bir TOF kütle analizörü içine akselere edilmiştir. Hatta, çok büyük biyomoleküllerin basitleştirilmiş spektrum analiz için tek yüklü türlerin moleküler iyon üreten az parçalanma ile iyonize edilebilir. Önceden türetme olmadan direkt lipit molekülleri analiz yeteneği lipidomic araştırma 18 MALDI-TOF MS hazır benimsenmesini teşvik etmiştir.

Bu kağıt saç deriye lipitleri izole ve analiz etmek için rutin bir yöntem sunuyor, sebase salgıları ve Doğu kırmızı yarasa plagiopatagium (Lasiurus borealis). Bu, beyaz Burun Sendromu (WNS) 22 hastalık sürecini açıklamak için bat deriye lipitlerinde türler arası farklılıklarını belirlemek için kullanılır. WNS yarasa bir mantar hastalığıdır ve Geomyces 23-25 ​​destructans yeni açıklanan psikrofilik türlerinin neden olur. WNS 5 milyondan fazla Kuzey Amerika mağara yarasaların ölümüne neden ve tarımsal sanayi 26,27 zarar milyarlarca dolar potansiyel ekonomik etkileri ile savunmasız yarasa türlerinin nesli, tehdit etti. G. adımları araştırmak enfeksiyon destructans, yağlar Doğu kırmızı sopaları saç ve kanat dokulardan ekstre edildi ve MALDI-TOF MS ile bir sonraki analiz için TAG fraksiyonunu izole etmek için TLC ile geniş lipid sınıfa ayrılır. TAG kısa asil zincirleri içeren ve kolay bir şekilde çok az müdahale ile matris MALDI-TOF MS ile tespit edilir.

Protocol

DİKKAT: peşin, taşıma taşıma ve yarasalar depolamak için tüm gerekli eyalet ve federal izinler alınmalıdır. Onayları kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, yanı sıra kurumsal biyogüvenlik komitesi den de temin edilmelidir. Canlı yarasalar (veya sinir sistemi dokusu) ele alınması ise, hayvan işleyicileri kuduz aşısı yapılmalıdır. Mevcut çalışmada kullanılan Yarasalar standart yöntemlerle (Arkansas State Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Kurulu onayı # 135349-1) 28 göre 2010 yaz döneminde Ozark Francis National Forest, AR, toplanmıştır. 1.. Doku Tedavi ve Lipid Ekstraksiyon Öncesi ve farklı bireyler doku toplama arasındaki metanol ile bütün aletleri temizleyin. Bir 125 ml Erlenmeyer şişesi içinde bir makas ve yer ile deriden saç (yaklaşık 1.0 g) kesin. Kloroform ile ıslatılmış pamuk topları 6 – 4 ile cildinizi ovarak kanat yüzeyinden numune sebum: Metanol solvent (C: M, 03:02 v / v), ve ayrı bir şişede, bu yerleştirin. C 10 ml doku ekstrakte: M (2:1 v / v) 29 oksidasyonunu önlemek için% 0.5 butile hidroksitoluen (BHT) ihtiva etmektedir. Sadece HPLC kaliteli solventler kullanmayın. 2 saat sonra, her bir şişeye 0.5 g susuz sülfat eklemek kısa bir süre karıştırmak ve filtre kağıdı içinden süzme ile çözücü toplar. Tekrar iki defa 1.2 ve 1.3 adımları. M.: Bir kere 1:1 C: 01:02 C M ve ardışık Havuz birlikte filtratları. N2 akışı altında bir araya getirilmiş filtratlar buharlaştırılmakta ve kuru ağırlığın belirlenmesi ve 3:02 C lipid tortu çözülür: 10 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar M (BHT ile% 0.5). -20 ° C de, cam şişeler saklayın örnek Bu örnek alınmasından sonra bir ay içinde örnekleri analiz etmek ve donma-çözülme döngüleri en aza indirmek için genellikle en iyisidir. 2. Preparatif ince-tabaka kromatografisi ile ayırma Lipid Önceden bir çözücü ile yıkanmış, 1.5 ml microce in hazırlanması, E, aseton ile durulanır ve hava-kurutma: C 03:02 ile doldurularak ntrifuge boruları. Bu, daha sonra kütle spektrometresi analizi engelleyebilir plastikleştirici kaldırmak için yapılır. Tozsuz bir kap içinde örnek tüplerini saklayın ve cilt yağları kirlenmesini önlemek için sadece eldiven ile bu tüpler anlaştım. M.: İlk 03:02 C ile ön geliştirerek TLC plakası etkinleştirin , 1 cm derinliğe kadar TLC bölmeye kadar çözücü ekleme sonra (kapat cam kapaklı) odacık içinde levhayı ve çözücü plakanın üstüne tamamen çalışmasına izin verir. Bu yaklaşık 45 dakika sürer. Çözücü buharlaşana (yaklaşık 15 dakika) kadar bir çeker ocak içinde plakası ve kurutun, daha sonra 120 ° C'de en az 10 dakika boyunca bir fırın içinde yer Numuneler uygulandığında yönünü sağlamak için levhanın üstünde bir kalem işareti koyun. Numune ve standartlar yerleştirileceği temel işaretlemek için, 1.5 cm levhasının alt kenarından, bir kurşun kalem çizgisinin düz yerleştirin. Bir kesim tarafından TLC haznesi hazırlayıniki kısa duvarları hat için yeterince büyük ve uzun bir duvar filtre kağıt parçası. Odacık içine filtre kağıdı astar yerleştirin. Solvent bölmeye tamamen ıslak eklenir zaman. Dietil eter: asetik asit solvent heksandır mobil faz, 100 ml hazırlayın (H: E: A; 80:20:2 v / v / v). Yaklaşık 1 sm kadar bir derinliğe vermek için bölme içine solvent dökün. Haznenin üst kenarı boyunca, bir silikon yağ mühür kullanılarak cam kapakla kapatın. Odası kullanmadan önce gece boyunca dengelenmeye bırakın. Diğer kenarına 1,5 cm bir kenarından yaklaşık 1.5 cm ila sürekli bir çizgi gibi bir kılcal boru veya pipet ile hazırlanan plaka elle örnek uygulanır. Bir daha homojen bir çizgi içinde örnek yüklemek beri bir otomatik numune aplikatör tercih edilir. Yaklaşık 20 ul sterol karışımı, SYAleri, TAG ve sterol ester standartlarını noktaya TLC plakasının dış şerit kullanın (10 mg kullanımı / ml; Premade karışımlar elde edilebilir). Içine yüklenen TLC plakasınıdengelenmiş kapak ile yakın odası, ve plaka geliştirmek çözücünün kadar üst kenarına çalışır. Bu, burada tarif edilen mobil faz ile yaklaşık 45 dakika sürer. Odasından plaka çıkarın ve fazla çözücü, yaklaşık 1 dakika boyunca bir çeker ocak içinde plakadan buharlaşmasına izin verin. % 95 etanol içinde% 0.05 rodamin 6G ile sprey. Uzun dalga boylu ultraviyole lamba altında lipid bantları görselleştirmek. Bir kalem ile Mark numune ve standartlara çözülmesi floresan bantları için R f pozisyon. Bir fotoğraf kayıtları bu noktada alınabilir. TAG standardına karşılık gelen bant tespit ve saydam kağıt ağırlığında büyük bir parça üzerine bir spatula ile silis kazınmasıyla plakasından çıkarın. Bir 1.5 ml solvent ile yıkanmış mikrosantrifüj tüpüne silis aktarın. 03:02 C 1.0 ml ilave edilir: M solvent örnek tüp, 1 dakika boyunca sonikasyon, santrifüjleme ile silis pelet ve daha sonra yeni bir önceden tartılmış bir tüp içine çözücüyü aktarın. Tekrar incie Önceki adım, süzülen havuz ve bir N2 akışı altında çözücü buharlaştırılır. Ek doku örnekleri, TLC ile ayrılır ise 4 ° C de karanlıkta N2 altında TAG içeren kuru tortu saklayın. Rhodamine 6G numunelerde mevcut olan, ancak heksan içinde çözünmez ve hemen MS analiz öncesi numune çözünme esnasında çıkarılır. 3. MALDI-TOF MS ile TAG Analizi Çözücü, 1 ml (49.5% etanol,% 49.5 asetonitril,% 1 ve% 0.1 sulu TFA) içinde 10 mg CHCA eritilmesi ile yeni bir α-siyano-4-hidroksi-sinnamik asit (CHCA) matrisi çözeltisi hazırlayın. 10 pmol / ul elde etmek üzere% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA) 39.5 ul ACTH (1 mg / ml) 1 ul karıştırılarak alet çözünürlük ve duyarlılık testleri için, adrenocarticotropic hormon (18-39 clip, 2465,1989 Da ACTH) hazırlanması stok solüsyonu. Bu durum daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Taze bir çalışma ACTH solut hazırlayın, 10 pmol / ul stok çözeltisinden 1 ul alma 9 ul% 0.1 TFA ile karıştırılması ve daha sonra, bir 500 fmol elde etmek için CHCA matris solüsyon içerisinde 10 ul (1:1) karıştırılarak iyon (1 pmol / ul) / ul konsantrasyonu. 03:02 C 10 mg / ml 'de TAG standartları hazırlayın: MALDI alet kalibrasyonu için M (örneğin tricaprin [470,361 Da], trikaprilin [554,455 Da], [638,549 Da] trilorin [722,642 Da] tripalmitin, [800,689 Da] tripalmitolein , [806,736 Da] trimiristin [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da] trioleİn ve trierucin [1052,971 Da]). Harici bir kilit kütleli TAG kalibrasyon standardı için M: 03:02 C 10 mg / ml 'de, triolein hazırlayın. 10 mg / ml solüsyon heksan içinde depolanmış TAG örnekleri çözülür. Bir 0.5 M (77,06 mg/1.0 mi) örnek ve standart bir matris olarak kullanmak için% 90 metanol ile, 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) stok çözeltisi hazırlayın. Ayrıca, bir NaOH 1.0 M (2.0 g/50.0 mi) solüsyon hazırlanır. Alüminyum folyo ile DHB çözeltisi ile tüp Kapak ışıktan korumak için l. Mix (önceden yıkanmış tüpler) 10,0 ul DHB matris, 10.0 ul örnek veya standart ve 5.0 ul 1.0 M NaOH. Karıştır ve kısaca alt karışımı getirmek için tüp santrifüj. Nokta kadar kuru bir desikatörde bir MALDI paslanmaz çelik hedef plakası ve yeri üzerine standart, numune veya ACTH 1.0 ul. Veri toplama için aracı haline hedef plakası yerleştirin. Gerçekleştirin MALDI-TOF MS pozitif reflektron modunda analiz eder. Ayarlama ve ACTH ve TAG standart çözeltiler kullanılarak cihazın üreticisi tarafından tarif edildiği gibi aleti kalibre edin. Hedef plaka üzerinde her bir örnek için tespit spektrumları elde edin (gösterge özellikleri ile tutarlıdır; bu iş için parametreler 5 Hz lazer ateşleme hızı, ortalama bir spektrum elde etmek için bir nokta başına ~ 100 çekim idi). MALDI spektrumları arka yumuşatma ve çıkarıldıktan sonra, online arama motoru LİPİT MAPS (manuel işlem iyon zirveleri/ Tools / ms / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). Öncü iyonların ve yoğunluğu kutusunun listesine liste spektrumları kopyalayın ve yapıştırın. Istenen asil bileşimine aramayı sınırlayın. Kütle / yük her numune için spektrumdaki mevcut iyonların (m / z) oranı ile tanımlamak TAG. Yağ asidi metil esteri (FAME) yüzdeleri ayrı GC / MS analizi varsa, mevcut TAG'lerin olasılıkları elde etmek için bu veri eklemek. GÖSTERGE: Bu çalışmada kullanılan kütle spektrometresi (bir 337 nm 20 Hz N 2 lazer ile donatılmış) bir Waters MALDI Micro MX olduğunu. Pozitif reflektron mod özelliği ile her üreticinin MALDI alet kullanılabilir. Reflektron, 5.200 V;; kullanılan genel ayarlar darbe gerilimi, 2.000 V olan kaynak, 15.000 V, MassLynx yazılımı (vers. 4.0) kullanarak veri toplama ile. Bu çalışma koşulları 12.000 daha fazla kütle çözünürlüğü sağlar.

Representative Results

Folch 30 tarafından tarif dokusundan toplam lipitleri izole etmek için ekstraksiyon yöntemi, burada uyarlanmış basit bir işlemdir. Doku çıkarımı ve çözücünün buharlaştırılmasından sonra, lipitler genellikle sarımsı bir film olarak görünür. Sarı renk, büyük olasılıkla, bir sıvı-sıvı ekstraksiyon yaparak kaldırılabilir kirletici protein, arasındadır. Hazırlayıcı TLC gibi kirleticilerden gelen TAG kısmını ayırır, çünkü bu ek örnek işleme Bu prosedürde gerekli değildir. Her filtre aşamalarında taze susuz sodyum sülfat ilavesi doğru lipid ağırlık saptamaları etkiler su kirlenmesini azaltır. Memeli deriye lipid H ile hazırlayıcı TLC analizleri: E: mobil faz olarak A genellikle steroller, FFAs, TAG'lerin ve sterol esterleri / balmumu esterleri / skualen (Şekil 1) (kökenli başlayarak) karşılık gelen dört ayrı bant çözecektir. Vesilesiyle analyti kullanırkenE: H ile cal yüksek performanslı (HP) TLC mobil faz, sterol esterler, mumsu esterleri ve skualen ayrı ve üç ayrı bantlar olarak görünecektir. Bu çalışmada kullanılan koşullar altında, sterol / balmumu esterleri ayrı değildir. Etil eter (95:5 v / v) ve HPTLC plakası taramalı dansitometre ile analiz edilebilir: Bu bantlar ilgi ise, mobil faz izooktan için değiştirilebilir. Diğer faktörler arasında kötü ayrılmasına neden olabilir. Bunlar genellikle tutarlı kalite TLC ayrımı ve veri elde etmek için, oda içindeki filtre kağıdı yerleştirme kapağın sıkı bir conta için tatbik yağ, bir gece boyunca odası dengeye ve temiz TLC odaları tutarak elimine edilir. Doğu kırmızı bat izole TAG'lerin elde Örnek MALDI-TOF kütle spektrumu, Şekil 2 ve 3'te gösterilmiştir. Non-sucul memeli izole TAG'lerin için tipik olan 910, – Bu spektrumları m / z 850 arasındaki kütle aralığında TAG iyon zirveleri içerirs. 1.0 M NaOH ilavesi, tek tek, H + iyonlarının daha stabildir Na + yüklü iyonlar teşvik etmektedir. Stabilitesi ilave olarak, H + ve K + iyonlarının yokluğu, spektrum analiz kolaylığını arttırmaktadır. M / z 850-910 iyon zirveleri 16:00, 18:00, 18:01 karşılık, ve 18:02 FA kısımları etiketleri baskın asil bileşenler (Tablo 1) olmak. TAG'lerin olası FA kısımları, başlangıçta total iyon m / z MALDI-TOF MS spektrumları olarak mevcut ve çıkarsanmış türleri ve bireyler arasındaki farklılıklar ile belirlenebilir. Asil içeriğin özel oranları gereklidir, ancak, daha sonra MS / MS ya da gaz kromatografisi (GC / MS) kullanılmalıdır. Asil oranlar hakkında daha fazla bilgi spektrumun diasilgliseridler bölgede bulundu (Şekil 4) 'de tepe noktaları gözlemleyerek çıkarsanabilir. Diasilgliseridler MALDI kaynak TAG parçalanma üretilir ve m / z 590 bulunabilir – 650 bölgesi. TAG parçalanma arttırılabilir1.0 M NaOH 16 ve buna ek olarak ihmal. Doğu kırmızı bat kanat doku m / z 881,8 (sırasıyla, Şekil 2 ve 3) en baskın tepe m / z 879,7 ve saç dokuda baskın bir pik ile karakterize edilir. M / z 907,8, 879,7, 855,7 ve (POP, PPOs) tepe değeri 853,7 olma ~% 40 sıcaklıktaki dorukla tüy dokusunda (~% 50) yoğunluğu da yaklaşık olarak. Bileşim Elemental Kompozisyon Gözlemlenen Kütle Na + TAG'lar Na + TAG'lar SSO C 57 H 108 O 6 911,8 OOS, LSS C 57 H 106 O 6 909.8 OOO, LnSS, LSO C 57 H104 Ç 6 907,8 LOO, LLS C 57 H 102 O 6 905,8 DÖİ, OOLn C 57 H 100 O 6 903,7 LLL C 57 H 98 O 6 901,7 LLLn C 57 H 96 O 6 899,7 LLnLn C 57 H 94 O 6 897,7 Lnlnln C 57 H 92 O 6 895,7 OSP C 55 H 104 O 6 883,8 LSP, OOP, Sopo C 55 H 102 O 6 881,8 LOP, LnSP, LSPo C 55 H 100 O 6 </ Td> 879,7 LLP, LNOP, lopo C 55 H 98 O 6 877,7 LnLP, LLPo, LnOPo C 55 H 96 O 6 875,7 LnLnP, LnLPo C 55 H 94 O 6 873,7 LnLnPo C 55 H 92 O 6 871,7 PPS C 53 H 102 O 6 857,8 POP, PPOs C 53 H 100 O 6 855.7 OOM, PPL, POPOS, Popo C 53 H 98 O 6 853,7 PPLn, ppol, PoPoO, MyOO C 53 H 96 O 6 851,7 LLM, LnOM C 53 H 94 </sub> O 6 849,7 PPP, SSLa C 51 H 98 O 6 829.7 PPPo, Osla C 51 H 96 O 6 827.7 PPoPo, PMYO C 51 H 94 O 6 825,7 LnLnLa C 51 H 86 O 6 817.6 MMS, tokat, PPM C 49 H 94 O 6 801,7 SLaPo, PPOM, PPMy C 49 H 92 O 6 799,7 PoPoM, OOCa C 49 H 90 O 6 797,7 MMP C 47 H 90 O 6 773,7 MMPo, Ocap C 47 H 88 O6 771,7 OCaPo C 47 H 86 O 6 769.6 MMM, PPCa, PMLa C 45 H 86 O 6 745.6 PoPCa, PoMLa C 45 H 84 O 6 743.6 Popoca C 45 H 82 O 6 741,6 LaLaP, MMLa, PD C 43 H 82 O 6 717,6 LaLaPo C 43 H 80 O 6 715,6 OO C 39 H 72 O 5 643,5 OL C 39 H 70 O 5 641.5 LL C 39 H 68 O 5 639.5 SP C 37 H 72 O 5 619,5 OP C 37 H 70 O 5 617,5 LP C 37 H 68 O 5 615.5 Tablo 1. Yağ asidi kompozisyonu, element bileşimi ve triasilgliseridler ve diasilgliseridler of sodiated adüktlerinin izotopik kütle. Ln = linoleik asit (18:3), L = linoleik asit (18:2), O = oleik asit (18:1), S = stearik asit (18:00), P = palmitik asit (16:00), Po = palmitoleik asit (16:01), M = miristik asit (14:00), En = miristoleik asit (14:1) La = laurik asit (12:00), Ca = kaprik asit (10:00). Şekil 1. Dietil eter: asetik asit heksan geniş lipid sınıf ayırma ince katmanlı kromatogram(80:20:2 v / v / v), mobil faz olarak. Sterol ve FFA arasında bir bant, bir standart ile tespit edilmemiştir, ancak bir yağlı alkol ya da diester mum olabilir. Şekil 2. Sodiated TAG'lerin MALDI-TOF kütle spektrumunun genişletilmiş TAG bölgesi. – Doğu kırmızı yarasa (L. borealis) kanat doku dan (m / z 700 950) m / z 853,7 (OOM, PPL, POPOS, Popo) ve m tespit Peaks / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 3,. Doğu kırmızı yarasa (L. borealis) saç doku dan – sodiated TAG'lerin (950 m / z 700) MALDI-TOF kütle spektrumunun genişletilmiş TAG bölgesi.M / z 905,8 (LOO, LLS) ve m / z 907,8 (OOO, LnSS, LSO) de tespit Peaks. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 4. Sodiated DAG parçalarının MALDI-TOF kütle spektrumu (m / z 530-730) ve DAG bölgesi. Doğu kırmızı sopasının (L. borealis) kanat doku m / z 643,5 (OO) ve m / z 615,5 (LP) de tanımlanan Merkezleri . büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Bu makale, lipid moleküllerinin zaman alıcı türetme olmaksızın, hazırlayıcı TLC ile memeli integument izole geniş bir lipit sınıfları ayrılması ve MALDI-TOF MS ile TAG profillerini belirlemek için basit ve sağlam bir yöntem sunar. MALDI-TOF MS ile TAG'lerin kalite spektrumları üretiminde kritik adımları içerir: en az kirlenme ya da oksidasyon ile bileşik 1) başarılı bir şekilde uzaklaştırılması; kromatografisiyle 2) yeterli ayırma ve izolasyon ve MALDI-TOF ile 3) Yüksek çözünürlük ve kütle hassasiyeti MS.

Bu kağıt TAG MS profillerini elde etmek için Doğu kırmızı yarasa plagiopatagium gelen nötral lipid kısmın ayrılması ve ayırarak yöntem gösterilmektedir. Bu çalışma bir yarasa türleri kullanılır iken (Mammalia: Chiroptera) bu yöntemlerin herhangi bir memeli türünün deriye lipitleri incelemek için uzatılabilir. Bat zar TAG, FFAs, squa düşük miktarda, esas olarak kolesterol olması ile karakterize edilirlene ve sterol / mum esterleri. (- Insanlarda% 7, ancak 26 – 1 yarasalardaki% 62) daha büyük bir kolesterol oranlarında işlem sırasında yarasalardaki Sebum lipid oranları bu skualen insanlarda farklıdır, (insanlarda kadar% 16 karşı) düşük miktarlarda mevcut olan 22 31. % 28 kadar oranlar Doğu kırmızı yarasa saç bulunur iken insan tüyler, yaklaşık% 3 TAG içerir. Bat'lardan lipid örneklerinin çıkarma diğer türler için benzer. Bu çalışmada, bir çözücü ile ıslatılmış pamuk topları sebum çıkarmak için kullanılır, bir de birden çok kez zar yüzeyi üzerine solvent ihtiva eden bir şişe ya da örnek tüpü ters olabilir. İhtisas bant ürünleri de yüzey lipidler 32 ayıklamak için alternatif yollar sağlar. Uygun bir lipid ekstraksiyon kritik bir parçası cildi yağdan kontaminasyonu minimize etmektir. Bu da, tüm numuneler ve giyen muayene eldivenleri arasında bir doku ile silme eşyaları, metanol ile bir sıkma şişesi tutmak ve her cam ve püskürtme aletleri ile gerçekleştirilir. Oksidasyon of çoklu doymamış asiller BHT eklenmesi ile önlenir, ve ne olursa olsun örnekleri arasında saklanan sıcaklığın kullanılmalıdır.

Biyomoleküler analiz genellikle kirliliklerden ilgi ayrı molekül için bir kromatografik adım gerektirir. TLC gaz ya da sıvı kromatografisi şartları enstrümantasyon önler ve sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için daha az bir teknik deneyim gerektirir, bu yöntemde, kullanılır. Ilgilenilen lipid sınıfına bağlı olarak, pek çok farklı mobil fazlar dahil edilebilir. Ayrıca, HPTLC plakaları ve tarama densitometresi kullanılmasıdır niceliksel sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. TLC yöntemlerin varyasyonları burada sayılamayacak kadar çok olmakla birlikte, lipid TLC içinde kullanılan bazı yaygın mobil fazlar, kloroform yer alır: non-polar lipidler 28 ayrılması için etil eter: metanol: fosfolipidler ve glikolipitler veya izooktan ayrılması için su. E: diğer lipit sınıfları, H TAG ayırma açısından, bir çoklvent sistemi sürekli çalışır ve karşılaştırılabilir sonuçlar sağlar.

TLC kullanmak için diğer bir avantajı, ilgi grupları hızla analitlerin önce türetme olmaksızın MALDI-TOF MS ile profilli olmasıdır. Bu çalışmada, silis TLC plakasına kaldırılır, ve, analit, yıkama çözücünün adsorban ve buharlaşma ayırmak için bir çözücü madde ve daha sonra santrifüj içinde sonikasyon ile ondan elüte edilir. Alternatif olarak, matris analit bantları TLC plakaları üzerinde ayrılmış ve daha sonra doğrudan MALDI-TOF MS ile analiz 33 üzerine direkt olarak tatbik edilebilir. MALDI-TOF MS tarafından Başarılı profilleme yeterli numune hazırlama ve ayarlama ve cihazı kalibre ile operatör yeterlilik itimat yok. Ilgilenilen moleküller için moleküler ağırlık aralığı, uygun düzgün kapsayan standartlara günlük olarak kalibre edilmelidir. Ekipmanın uygun hassasiyet ve çözünürlük (örneğin, ≥ 10.000) da onaylanmıştır olmalıdırACTH günlük d.

Memeli integument yüzeyinde bulunan yağ lipid bileşenleri bakteri / mantar patojenler tarafından kolonizasyonuna bir rol oynayabilir. Bu nedenle türler ve bireyler arasında kimyasal bileşimi bilgi insan ve yaban hayatı hastalıklarının süreçleri hakkında ipuçları sağlayabilir. Hastalıklı ve sağlıklı bireyler arasında intraspecific farklılıklar klinik belirtilerini temsil edebilir ki hastalık teşhis ve tanı yardım. Mikrobiyal büyümeyi önleyen spesifik bileşikler mevcut Ayrıca, eğer, bu hastalıkların tedavisi ve önlenmesinde kullanım için tespit edilebilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yardım laboratuvar yöntemlerinin geliştirilmesi sırasında Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, ve Cheyenne Gerdes'ten sağlandı. TLC tarama densitometri ile yardım için, biz Medine-Bolivar Laboratuvarı (Arkansas Bıoscıences Enstitüsü Luis H. Nopo-Olazabal) teşekkür etmek istiyorum. Arkansas Biosciences Enstitüsü Arkansas VARLIĞI Girişimi P3 Merkezi (EPS-0701890): MALDI-TOF MS bu proje için kullanılan NSF EPSCoR, Rll'nin yoluyla sağlanmıştır. Finansman ABD Balıkçılık ve Vahşi Yaşam Servisi / Arkansas State Wildlife Grant, Ulusal Mağara Derneği, ve Indiana State Üniversitesi'nde Kuzey Amerika Bat Araştırma ve Koruma Merkezi tarafından sağlandı.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg
Sebutape CuDerm S100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today’s pre-clinical data into tomorrow’s daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. . Principles of Biochemistry. , (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P., Lorence, A. . Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. , (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R., Cole, R. B. . Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. , 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption – ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Tags

TriacylglyceridesSebumLipid CompositionThin-layer ChromatographyMALDI-TOF Mass SpectrometryMammalian IntegumentInnate Immune SystemSkin Diseases

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image