Summary

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em> Burkholderia</em> Especies

Published: October 15, 2013
doi:

Summary

Los miembros del género Burkholderia son patógenos de importancia clínica. Se describe un método para la extracción de proteína total bacteriana, usando disrupción mecánica, y electroforesis en gel 2-D para el análisis proteómico posterior.

Abstract

La investigación de los niveles de proteína intracelular de especies bacterianas es de importancia para la comprensión de los mecanismos patogénicos de las enfermedades causadas por estos organismos. Aquí se describe un procedimiento para la extracción de proteína a partir de especies de Burkholderia basado en la lisis mecánica usando perlas de vidrio en presencia de ácido tetraacético etilendiamina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo en tampón fosfato salino. Este método se puede utilizar para diferentes especies de Burkholderia, para diferentes condiciones de crecimiento, y es probable adecuado para el uso en los estudios proteómicos de otras bacterias. Tras la extracción de proteínas, una de dos dimensiones (2-D) electroforesis en gel de la técnica proteómica se describe para estudiar los cambios globales en los proteomas de estos organismos. Este método consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, seguida de separación sobre la base de peso molecularpor electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. La visualización de proteínas separadas se lleva a cabo mediante tinción con plata.

Introduction

El género Burkholderia comprende más de 62 especies, organismos Gram negativas aisladas a partir de una amplia gama de nichos, y se divide en dos grupos principales 1,2. El primer grupo incluye a los organismos phytotrophic humana, animal y, y la mayoría de los estudios se han centrado en las especies patógenas de este grupo debido a su importancia clínica. Los miembros más patógenas son B. y B. pseudomallei mallei (que causa melioidosis y el muermo, respectivamente) y 3,4 patógenos oportunistas (las 17 especies definidas del complejo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causan la enfermedad de la fibrosis quística (FQ) y enfermedad granulomatosa crónica (CGD) 1. El segundo grupo, con más de 30 especies no patógenas, incluye bacterias asociadas a las plantas o al medio ambiente, y se consideran potencialmente beneficioso para el host 2.

Numerosas complicaciones surgen frinfección bacteriana OM con los miembros patógenas del género Burkholderia, como la transmisión del patógeno entre los pacientes, propagación de la enfermedad y el fracaso del tratamiento debido a la resistencia intrínseca o adquirida a los antibióticos que hacen difícil de erradicar en la mayoría de los casos 6-9. Por lo tanto, obtener una comprensión más clara de la base para el establecimiento de la infección bacteriana es vital para el tratamiento de enfermedades causadas por estos organismos. Con el fin de profundizar en el establecimiento de la infección, se requieren extensas investigaciones sobre los componentes bacterianos asociados con la patogénesis. Los estudios centrados en el análisis proteómico de organismos Burkholderia utilizando enfoques proteómicos describen proteínas que han sido implicados en la patogénesis bacteriana, así como cambios en su proteoma perfiles 10-16.

Métodos de extracción de proteínas utilizando ultrasonidos y los ciclos de descongelado por congelación en tampón de lisis que contiene alta concentration de urea, tiourea en combinación con detergente y anfolitos se ha aplicado en Burkholderia estudios proteómicos 10-13. Aunque la urea es bastante eficiente para la desnaturalización de la proteína, se puede establecer un equilibrio en solución acuosa con isocianato de amonio, que puede reaccionar con los grupos de aminoácidos, formando de este modo artefactos (reacción de carbamilación) 17. Por lo tanto, se recomienda incluir anfolitos portadores, que actúan como eliminadores de cianato y evitar temperaturas por encima de 37 ° C 17. Además, para evitar cualquier interferencia química de tampón de lisis con la cuantificación de proteínas, el mismo tampón de lisis se puede utilizar para generar la curva estándar de modo que las muestras y los estándares tienen el mismo fondo 10. Otras metodologías implican el uso de tampones alcalinos y detergentes con períodos de incubación de calor 17,18; sin embargo estas condiciones podría inducir cambios en el proteoma y algunos detergentes no son compatibles con PRoteomics solicitud a menos que se incluyen los pasos subsiguientes de eliminación de detergente 17,18.

Después de la extracción y cuantificación adecuada, expresión global de proteína de cada proteína individual se puede estudiar usando enfoques proteómicos tales como bidimensional (2-D) electroforesis en gel. Esta técnica fue descrita por primera vez por O'Farell 19 y consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, y a continuación, en función de su peso molecular por electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. Debido a su resolución y sensibilidad, esta técnica es una herramienta poderosa para el análisis y la detección de proteínas a partir de fuentes biológicas complejas 19,20. Esta técnica de separación está actualmente disponible en los enfoques centrados en la proteína con la gran ventaja de la solución de isoformas de proteínas causadas por modificaciones post-transcripcionales o procesamiento proteolítico. Los cambios cuantitativospuede ser detectado mediante la comparación de la intensidad de la mancha correspondiente después de la tinción del gel 20. Sin embargo, esta técnica no es adecuada para la identificación de proteínas muy grandes, proteínas de membrana, proteínas muy básicas y ácidas o hidrófobos, y es una técnica algo laborioso y requiere mucho tiempo 20. Nuevos enfoques-péptido centrado (basadas en gel de no) que son más robustos y objetivo estén disponibles y se pueden utilizar para la comparación cuantitativa por métodos diferenciales de etiquetado de isótopos estables tales como el etiquetado de cisteína por afinidad isótopo codificados etiquetado (ICAT) 21, y grupo amino etiquetado por el etiquetado de isótopos para la cuantificación absoluta y relativa (iTRAQ) 22. El uso de una única técnica de proteómica podría dar información insuficiente, por lo que es necesario el uso de dos enfoques proteómicos complementarias para la mayoría de los cambios totalmente en la evaluación de proteoma. Sin embargo, la electroforesis en gel 2-D es ampliamente utilizado y se puede aplicar de forma rutinaria para Quancuantitativos de expresión de varias proteínas en diferentes organismos.

Aquí se describe una extracción de proteínas de células enteras y procedimientos de electroforesis en gel 2-D para las especies de Burkholderia que fueron adaptados y optimizados de la GE Healthcare 2-D electroforesis Principios y métodos Manual 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). La extracción de proteínas se llevó a cabo usando un batidor de bolas con perlas de vidrio en presencia de PBS que contenía EDTA 5 mM (ácido etilendiaminotetraacético) y 1 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Este procedimiento permite la cuantificación de proteínas con la mínima degradación y es modificable para las aproximaciones proteómicas como se informó anteriormente 15,23,24. Electroforesis en gel 2-D se llevó a cabo utilizando 24 cm de largo inmovilizadas de pH 4-7 gradiente y las proteínas se separaron de acuerdo con su punto isoeléctrico. Luego se separaron las proteínas en función de su molecpeso cular por gel de SDS-poliacrilamida. Además, describimos un método de tinción de plata para la visualización de proteínas in situ, y un método de tinción de plata que es compatible para el análisis de espectrometría de masas. En conjunto, estos procedimientos pueden permitir la identificación de proteínas importantes de especies de Burkholderia que podrían estar involucrados en la patogénesis.

Protocol

1. Crecimiento Cultura (días 1 2) Haga crecer un cultivo iniciador: 3 ml de Luria Bertani (LB) caldo en un tubo a presión superior de 15 ml, a 37 ° C durante la noche de los rotadores. Diluir el crecimiento durante la noche a un OD 600 de 0,6. Añadir 1 ml de esta dilución a 100 ml de caldo LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm durante 16 h en fase estacionaria (SP), a una mejor aproximada, en un cultivo discontinuo, condiciones de infección y para as…

Representative Results

Análisis comparativo de los perfiles de proteínas extraídas de un mismo cultivo bacteriano en dos ocasiones diferentes mostraron patrones similares de bandas indicando extracciones de proteínas con éxito. Proteínas de peso molecular extraídos oscilaron desde 10 hasta 150 kDa. La Figura 1 muestra representativa de Coomassie de gel de tinción de azul de las extracciones de proteínas de células enteras de multivorans Burkholderia (un miembro de la BCC) aislados clínicos cultivadas en LB…

Discussion

Un método para la preparación de proteínas se ha descrito que puede extraer la mayoría de las proteínas Burkholderia con buena reproducibilidad. Esto se demuestra mediante la obtención de la misma perfil de proteínas a partir de dos preparaciones independientes realizados en diferentes días utilizando el mismo cultivo bacteriano crecido en LB o caldo YEM como se muestra en la Figura 1. La extracción fue eficiente para las bacterias cultivadas en medio líquido, sin embargo no hemos pro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una beca de la Universidad de British Columbia (BV) y las subvenciones de la Fibrosis Quística Canadá y canadienses Institutos de Investigación en Salud (DPS). Damos las gracias a Jacqueline Chung para la preparación inicial de los protocolos.

Materials

Reagents
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
Acetone Fisher A18-1 Flammable
PBS Buffer Bioscience R028
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
Agarose Invitrogen 15510-027
Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
Sodium acetate EM Science 7510
Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
Sodium thiosulfate Sigma S7026
Tris Base EMD 9230
Glycine MPBiomedical, LCC 808831
Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
Mineral oil ACROS 415080010
Equipment
JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

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Velapatiño, B., Zlosnik, J. E. A., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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