Artiklen beskriver en metode til fremstilling af en acellulær matrix fra rotte tarmen. Udledningen af tarm stilladser er vigtig for fremtidige ansøgninger i tissue engineering, stamcelle biologi og narkotika testning.
Vellykket vævsmanipulering involverer kombination af stilladser med passende celler in vitro eller in vivo. Stilladser kan være syntetisk, naturligt afledt eller stammer fra væv / organer. Sidstnævnte opnås ved hjælp af en teknik kaldet decellularization. Decellularization kan indebære en kombination af fysiske, kemiske og enzymatiske metoder. Målet med denne teknik er at fjerne alle cellulære spor samtidig med at den makro-og mikro-arkitektur af den oprindelige væv.
Intestinal tissue engineering har hidtil anvendt relativt simple stilladser, der ikke kopierer den komplekse arkitektur indfødte orgel. Fokus i denne artikel er at beskrive en effektiv decellularization teknik til rotte tyndtarmen. Isoleringen af tyndtarmen for at sikre opretholdelsen af en vaskulær forbindelse er beskrevet. Kombinationen af kemiske og enzymatiske løsninger til at fjerne cellerne whilst bevare villus-crypt akse i luminale aspekt af stilladset er også fastsat. Endelig vurdering af producerede stilladser til relevante karakteristika diskuteret.
Tissue engineering (TE) giver en terapeutisk alternativ til organtransplantation, uden om spørgsmål af immunosuppression og organmangel. TE har for nylig haft vellykkede applikationer i klinikken, med udskiftning af organer såsom blæren 1, urinrøret 2 og luftrør, både voksne 3,4 og børn 5.
Opbygning af et væv-manipuleret organ nødvendiggør en kombination af et stillads med de relevante celler. Et stillads kan fremstilles ved hjælp af naturligt afledt (fx collagen) og syntetisk (f.eks poly-L-glycolsyre; PLGA) materialer eller opnås ved decellularization indfødte organer og væv. Stilladser, der er blevet anvendt hidtil til intestinal TE hovedsagelig har været enten decellulariseret (lille tarmsubmucosa) eller syntetiske (poly-L-glycolsyre og poly-mælkesyre) 6-13. Disse biomaterialer er meget enkel i både makro-og mikro-arkitektur, somkan ikke være ideelt, hvis væv-manipuleret tarmen skal klinisk oversættes. En optimal biomateriale til tarmen, bør have en medfødt vaskulær træ, der kan tilsluttes til værten blodforsyning, en trinvis rørformet væg med forskellige egenskaber for at afspejle de lag af den intestinale væg og en villus-crypt aksen på den luminale side at støtte med repopulation af epitel stamceller.
Decellularization er en roman metode, der producerer stilladser ved at fjerne celler fra hele organer, samtidig med at de bevarer deres oprindelige arkitektur 14. Dette er at foretrække frem for eksisterende stillads, eftersom de ikke kun replikere strukturen af organet, men også indeholder kemiske signaler indlejret i den ekstracellulære matrix (ECM), som støtte cellulær proliferation og differentiering. I 2008 blev en cadaveric luftrøret blev decellulariserede 14, podes med patientens egne celler, og transplanteres til at erstatte de vigtigste venstre bronkier i en ung mand <sup> 3. Siden da har en række grupper rapporterede produktionen af decellulariseret stilladser til hjertet 15, lever 16,17 og lunge 18-20 i små og store dyr.
Vi har også tilpasset den samme metode til at producere en tyndtarmens decellulariseret stillads 21. Målet med den heri beskrevne fremgangsmåde er at producere decellulariseret tarm matricer, der opretholder de makroskopiske egenskaber af det oprindelige væv, såsom blodforsyning, samt mikroskopisk arkitektur af villus-crypt akse i det intestinale lumen. Vi mener, at denne metode kan i sidste ende blive vedtaget for andre organer til at forbedre effektiviteten af decellularization.
De mest vanskelige skridt i oprettelsen af dette eksperiment indebærer kanylering af SMA og etablering og vedligeholdelse af sterilitet. Kanylering SMA hos gnavere uden brud på væggen kan være ganske vanskeligt på grund af størrelse og placering af fartøjet. Alternativt kan en sutur anbragt omkring den proksimale aorta forud for SMA oprindelse, efterfulgt af kanylering af aorta sig distalt dirigere plastikkanylen i SMA. Under decellularization en kombination af dårlig kanyle placering og høje strømningshastigheder kan resultere i at miste den vaskulære adgang. Sterilitet er et stort problem på grund af mængden af bakterielle flora, der findes i tyndtarmen. Vask med PBS / AA efter høst er meget vigtig, og ethvert tegn på afføring eller snavs skal fjernes fra lumen. Placering af en del af stilladset i et Falcon-rør med DMEM i inkubatoren efter UV-sterilisering skal være en indikator, hvis sterilitet er opnået. I tilfældeaf bakteriel kolonisering, vil medierne ændre pH med sin farve vender fra rød til gul. At beskæftige sig med dette, rådes yderligere UV-cykler samt vask med PBS indeholdende en høj koncentration af antibiotikum / antimykotikum.
En mulig modifikation for at opnå et stillads med både vaskulære og venøs adgang ville være at cannulate inferior vena cava (IVC) samt SMA. Decellularization fra venøse og vaskulære sider bør forsøges med mellemrum for alle tre løsninger. Kontinuerlig decellularization kan briste kapillærerne ved at have positivt tryk på begge sider.
Gennem årene har der været en række indsatser på tarm TE ved hjælp af forskellige celle-stillads kombinationer in vitro og in vivo 6,9,12. Størstedelen af arbejdet er udført ved hjælp af rørformede nonwoven 95% PGA-5% PLGA stilladser overtrukket med collagen type I 6,7,13,22. Efter såning med tarmepiteliale organoide enheder (OUS) og en periode på implantation i omentum af mus, danner cyster med muskel på ydersiden og epitel på indersiden, som derefter kan tubularized. Imidlertid porøsitet og enkelhed i udformningen af disse scaffolds ikke tillade til frembringelse af store stykker af kunstig tarm i et in vitro miljø, som den af en bioreaktor. Derudover mangler en medfødt vaskulære netværk, der kan forbindes til modtageren begrænser yderligere anvendelsen af dette stillads til klinisk oversættelse. Ud over forsøgene med PGA-PLGA scaffolds har andre grupper anvendt collagen eller SIS stilladser, som begge ikke replikerer forviklinger af tarmkanalen. SIS i særdeleshed er den eneste tidligere offentliggjorte metode tarmvæv teknik og er blevet anvendt i mere end 150 medicinske indstillinger demonstrere evne decellulariseret stilladser at tilvejebringe mekanisk stabilitet og fremme cellevækst mens blyning til ingen immunogen reaktion. Men mangel på passende makro-og mikro-arkitektur, har ført til dårlige resultater i sin »brug for intestinal TE formål 9-11,23.
Fordelene ved decellularization metode, vi har beskrevet, omfatter beskyttelse af mikroskopiske karakteristika såsom den luminale krypt-villus arkitektur, der repræsenterer et passende miljø for genoprettelse af tarmens stamceller niche. I den makroskopiske aspekt, vil tilstedeværelsen af en hierarkisk vaskulære netværk muliggøre fastgørelse til modtageren, således at levering af næringsstoffer og ilt til alle lag af TE-tarmen 21. Hvad mere er, vedligeholdelse af ECM komponenter såsom collagen, elastin og glyocosaminoglycans har en vigtig rolle ikke kun for mekaniske egenskaber, men også at dirigere cellulær proliferation og differentiering. Vigtigst er det, at evnen af decellularization metode skaleres op i storer væv og samtidig fastholde de samme egenskaber er en vigtig egenskab for klinisk oversættelse af TE.
Udviklingen af en naturlig tarm matrix med en vaskulær netværk giver mulighed for etablering af større segmenter af kunstig tarm, der kan tilsluttes til værten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Wake Forest Institute for regenerativ medicin for deres hjælp med udviklingen af denne protokol. Vi anerkender støtte af tilskud fra Great Ormond Street Hospital velgørenhed Fonden Eugenio Litta (Genève, Schweiz), Medical Research Council, Royal College of Surgeons of England, Sparks Børns Medical Charity, det britiske udenrigsministerium for UK / USA Stem Cell Collaboration Award og Mittal Research Fund. Vi vil også gerne takke Royal Society / Wolfson Institut til tissue engineering laboratorium renovering tilskud opnået for Pediatric Surgery Department i Institute of Child Health. PDC og SE er understøttet af Great Ormond Street Hospital Børns Charity.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |