Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix
Summary
Der Artikel beschreibt eine Methode für die Herstellung einer azellulären Matrix aus Rattendarm. Die Ableitung von Darm Gerüste ist wichtig für zukünftige Anwendungen im Tissue Engineering, Stammzellbiologie und Drogentests.
Abstract
Erfolgreicher Gewebetechnik beinhaltet die Kombination von Gerüsten mit den entsprechenden Zellen in vitro oder in vivo. Gerüste können synthetisch, natürlich gewonnenen oder aus Geweben / Organen abgeleitet ist. Letztere werden unter Verwendung einer Technik, die Dezellularisierung erhalten. Dezellularisierung kann es sich um eine Kombination von physikalischen, chemischen und enzymatischen Methoden. Das Ziel dieser Technik ist es, alle zellulären Spuren unter Beibehaltung der Makro-und Mikroarchitektur des ursprünglichen Gewebes zu entfernen.
Darmgewebetechnik bisher verwendeten relativ einfache Gerüste, die die komplexe Architektur der nativen Organ nicht replizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist es, eine effiziente Technik zur Dezellularisierung Rattendünndarms zu beschreiben. Die Isolierung des Dünndarms, um die Aufrechterhaltung einer Gefäßverbindung sicherzustellen beschrieben. Die Kombination von chemischen und enzymatischen Lösungen, um die Zellen zu entfernen whilst Erhaltung der Zotten-crypt-Achse in der luminalen Aspekt des Gerüsts wird auch eingestellt. Schließlich Beurteilung der hergestellten Gerüste für entsprechende Eigenschaften wird diskutiert.
Introduction
Tissue Engineering (TE) bietet eine therapeutische Alternative zur Organtransplantation, unter Umgehung Fragen der Immunsuppression und Organknappheit. TE hat vor kurzem erfolgreiche Anwendungen in der Klinik, mit dem Austausch von Organen wie der Blase 1, 2 Harnröhre und der Luftröhre, sowohl bei Erwachsenen und Kindern 5 3,4.
Aufbau einer Tissue-Engineering Organ erfordert die Kombination aus einem Gerüst mit den entsprechenden Zellen. Ein Gerüst kann unter Verwendung von natürlich-abgeleiteten (z. B. Kollagen) hergestellt werden, und synthetische (z. B. Poly-L-Glykolsäure; PLGA)-Materialien oder durch die Dezellularisierung von nativem Gewebe und Organen erhalten werden. Gerüste, die bisher für die Darm TE verwendet wurden, waren hauptsächlich entweder dezellularisierte (Dünndarm-Submukosa) oder synthetischen (Poly-L-Glykolsäure und Poly-Milchsäure) 6-13. Diese Biomaterialien sind sehr einfach sowohl in der Makro-und Mikro-Architektur, diemöglicherweise nicht ideal sein, wenn Gewebezüchtung Darm ist klinisch übersetzt werden. Eine optimale Biomaterial für den Darm sollte eine angeborene Gefäßbaum, die der Host-Blutversorgung, einer abgestuften Rohrwand mit unterschiedlichen Eigenschaften, die Schichten der Darmwand zu reflektieren und einer Zotten-crypt-Achse auf der luminalen Seite verbunden werden können, um mit Hilfe haben Wiederbesiedlung von epithelialen Stammzellen.
Dezellularisierung ist eine neuartige Methode, die Gerüste produziert, indem sie Zellen aus Voll Organe unter Wahrung ihrer ursprünglichen Architektur 14. Dies ist bevorzugt, um bereits bestehende Gerüste, da sie nicht nur die Struktur des Organs zu replizieren, sondern auch enthalten chemische Signale in der extrazellulären Matrix (ECM), dass die Hilfe zelluläre Proliferation und Differenzierung eingebettet. Im Jahr 2008 wurde ein Leichenluftröhre dezellularisiert 14, mit patienteneigenen Zellen besiedelt und transplantiert werden, um die wichtigsten linken Bronchus bei einem jungen Mann zu ersetzen <sup> 3. Seitdem haben eine Reihe von Gruppen die Produktion von dezellularisiertes Gerüste für das Herz 15, Leber 16,17 und Lunge 18-20 in kleinen und großen Tieren berichtet.
Wir haben auch die gleiche Methode, um eine kleine Darm dezellularisiertes Gerüst 21 produzieren angepasst. Das Ziel der hierin beschriebenen Verfahren ist die dezellularisierte Darm Matrizen, die die makroskopischen Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, wie die Blutzufuhr als auch die mikroskopische Architektur der Zotten-Kryptenachse im Darmlumen aufrechtzuerhalten erzeugen. Wir glauben, dass diese Methode könnte letztlich für andere Organe angenommen, um die Effizienz der Dezellularisierung verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die schwierigsten Schritte bei der Einrichtung dieses Experiment beinhalten die Kanülierung der SMA und die Errichtung und Wartung von Sterilität. Kanülierung des SMA bei Nagern ohne Zerreißen der Wand kann ziemlich schwierig aufgrund der Größe und Position des Schiffes sein. Alternativ kann ein Nahtmaterial um den proximalen Aorta vor der SMA Herkunft angeordnet werden, gefolgt durch Kanülierung der Aorta selbst distal Leiten des Kunststoffkanüle in die SMA. Während Dezellularisierung eine Kombination von schlechter Kanüle Platzierung und hohe Durchflussraten in den Gefäßzugang zu verlieren, führen. Sterilität ist ein großes Problem wegen der Menge der im Dünndarm vorhanden Bakterienflora. Waschen mit PBS / AA nach der Ernte ist sehr wichtig, und jedes Zeichen von Fäkalien oder Verunreinigungen müssen aus dem Hohlraum entfernt werden. Anordnen eines Teils des Gerüstes in ein Falcon-Röhrchen mit DMEM in den Inkubator nach UV-Sterilisation sollte ein Indikator sein, wenn Sterilität erreicht. Im Falleder bakteriellen Besiedlung, wird die Medien den pH-Wert mit seiner Farbe Drehen von rot nach gelb ändern. Um damit umzugehen, sind weitere UV-Zyklen, wie gut beraten wie Waschen mit PBS, das eine hohe Konzentration an Antibiotikum / Antimykotikum.
Eine mögliche Änderung an ein Gerüst sowohl mit Gefäß-und Venenzugang zu erhalten, wäre es, die untere Hohlvene (IVC) sowie die SMA kanülieren. Dezellularisierung aus den Venen-und Gefäß Seiten sollten intermittierend für alle drei Lösungen versucht. Kontinuierliche Dezellularisierung können die Kapillaren mit positiven Druck auf beiden Seiten platzen.
Im Laufe der Jahre gab es zahlreiche Versuche im Darm TE unter Verwendung verschiedener Zellgerüst-Kombinationen in vitro und in vivo 6,9,12. Der Großteil der Arbeit wurde durchgeführt unter Verwendung von rohrförmigen Vliesstoff 95% PGA-5% PLGA Gerüste mit Kollagen Typ I beschichteten 6,7,13,22. Nach der Aussaat mit DarmEpithelzellen organoiden Einheiten (OU) und eine Periode der Implantation in das Netz von Mäusen, Zysten bilden sie mit Muskel auf der Außenseite und Epithel auf der Innenseite der dann tubularized werden können. Allerdings ist die Porosität und die Einfachheit in der Konstruktion dieser Gerüste ermöglicht nicht für die Erzeugung von großen Stücken von Kunstdarm in einem in vitro-Umgebung wie der eines Bioreaktors. Zusätzlich kann das Fehlen einer angeborenen Gefäßnetz, die an den Empfänger weiter verbunden werden können, begrenzt die Verwendung dieses Gerüst für klinische Übersetzung. Neben den Versuchen mit den PGA-PLGA Gerüste haben andere Gruppen SIS Kollagen oder Gerüste, die beide nicht die Komplexität des Darmtrakts verwendet replizieren. SIS ist vor allem der bisher einzigen veröffentlichten Methodik der Darmgewebetechnik und hat in mehr als 150 medizinischen Einrichtungen eingesetzt worden, was die Fähigkeit der dezellularisiertes Gerüste auf mechanische Stabilität und fördern das Zellwachstum, während Bleiten zu keiner Immunreaktion. Doch der Mangel an passenden Makro-und Mikro-Architektur, hat schlechte Ergebnisse in ihrem "Einsatz für die Darm TE Zwecke 9-11,23 geführt.
Die Vorteile der Dezellularisierung Methodik, die wir beschrieben haben, gehören die Erhaltung der mikroskopischen Eigenschaften wie der Lumen Krypta-Zotten-Architektur, die ein geeignetes Umfeld für die Wiederbevölkerung repräsentieren durch die Darmstammzellnische. Im makroskopischen Aspekt wird das Vorhandensein eines hierarchischen Gefäßnetz ermöglichen die Befestigung an den Empfänger, so dass Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff zu allen Schicht des TE 21-Darm. Darüber hinaus hat die Aufrechterhaltung der ECM-Komponenten wie Kollagen, Elastin und glyocosaminoglycans eine wichtige Rolle nicht nur mechanische Eigenschaften, sondern auch die zelluläre Proliferation und Differenzierung lenken. Am wichtigsten ist, die Fähigkeit der Dezellularisierung Methodik in große skaliertr Gewebe unter Beibehaltung der gleichen Eigenschaften ist ein wichtiges Merkmal für die klinische Umsetzung von TE.
Die Entwicklung eines natürlichen Darmmatrix mit einer Gefäßnetz ermöglicht die Erstellung von größeren Segmente der künstlichen Darm, die mit dem Host verbunden werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Wake Forest Institut für Regenerative Medizin für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken für die Unterstützung durch Zuschüsse aus dem Great Ormond Street Hospital Nächstenliebe, die Stiftung Eugenio Litta (Genf, Schweiz), das Medical Research Council, dem Royal College of Surgeons of England, die Funken für Kinderheilnächstenliebe, des britischen Außenministeriums für die UK / USA Stammzell Collaboration Award und dem Forschungsfonds Mittal. Wir möchten auch, um die Royal Society / Wolfson-Stiftung für die für die Kinderchirurgie-Abteilung im Institut der Kind-Gesundheit erhalten Tissue Engineering Labor Sanierung Zuschuss danken. PDC und SE werden von der Great Ormond Street Hospital Kinderhilfswerk unterstützt.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
References
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