형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em> 제자리에서</em에서> 하이브리드<em> 사카 cerevisiae의</em

그림 1과 2는 물고기 실험 절차 및 FISH 이미지를 정량화에 사용되는 이미지 분석 파이프 라인의 회로도이다. 1. 준비 할 솔루션 * 아래 솔루션은 가수 프로브와 함께 사용하기위한 것입니다. 스텔라리스 프로브를 사용하는 경우, 하이브리드 버퍼 및 세척 버퍼 모두에서 "10 %의 포름 아미드"로 "40 % 포름 아미드"을 대체합니다. 하이브리드 버퍼에 추가로 변경 스텔라리스 프로브를 사용하여 (1) 1g 덱스 트란 황산을 추가하고 (2) 10 ㎎ ssDNA에 포함되지 않습니다이다. 버퍼 B 8 ML 1 M KH 2 PO 4 41.5 ML 1M K 2 HPO 4 소르비톨 109.3 g Spheroplasting 버퍼 890 μL 버퍼 B 100 μL VRC 10 μL 25,000 U / ㎖ Lyticase 2 μL β-메르 캅 토 에탄올 <강해> 하이브 리다이 제이션 버퍼 (10 ㎖, 최종 볼륨) 10 ㎎ E. 대장균 tRNA의 10 ㎎ ssDNA하기 * 100 μl의 200 mM의 VRC 주식 50 MG / ML BSA의 40 μL 1 ML 20X SSC 4 ML 40 % 포름 아미드 * 핵산 무료 물 (10 ㎖ 최종 볼륨) 1g 덱스 트란 황산 * * 하이브리드 버퍼 편의를 위해 -20 ° C에서 0.5 ML의 aliquots에 보관 될 수 있습니다. (50 ml의 최종 볼륨) 버퍼를 씻어 5 ML 20X SSC 20 ML 40 % 포름 아미드 * 핵산 무료 물 (50 ML 최종 볼륨) 버퍼 레이블 1.06 g 나트륨 탄산염 100 ML DEPC 물 pH가 9 2. 프로브 라벨 (가수 프로브 만) 우리는 ABI 올리고 뉴클레오타이드 합성 장치를 사용하여 사내 합성하여이 프로브를 얻을 수 있습니다. Typic동맹은 4-5 ~ 50 염기쌍 올리고 뉴클레오티드는 바람직하게는 10 적어도 8 + BP 이격 여러 thymidines에 대한 아미노 알릴 티미 딘을 대체, 관심의 유전자 상동하는 합성된다. CY 염료를 사용하는 경우 때문에 오존 민감성, 우리는 오존이없는 시설에서 작동합니다. ~ 5 프로브를 취득하고 100 μL 물에 resuspend을 – Nanodrop 분광에 체크 농도를. 얼마나 많은 프로브 / 유전자, 10 μg의 올리고 뉴클레오티드 / 유전자의 전체 조합에 따라 (예를 들면 5 프로브 / 유전자가 다음 2 ㎍ / 프로브를 원하는 경우). QIAquick 염기 제거 키트 프로토콜에 따라 프로브를 정화 QIAquick 열을 사용합니다. 버퍼 PN이 결합 된 프로브 및 믹스의 볼륨을 합계하기 위하여 10 볼륨을 추가합니다. QIAquick 열에 샘플을 적용 – 총 부피가 750 ㎕의보다 큰 경우, 각 스핀에 볼륨의 절반을 사용하여 두 번 스핀 다운 1 분 동안 서 보자. 6,000 rpm에서 1 분 원심 분리기. 750 μL 버퍼 PE로 씻으십시오. 원심 분리6,000 rpm에서 1 분. 건조 13,000 rpm에서 1 분간 통해 흐름과 재 스핀 열의 폐기하십시오. H 2 O의 pH가 7.0 및 8.5에서이며 막에 직접 배치되어 있는지 확인하십시오 – 새로운 microcentrifuge 관 50 μL H 2 O와 용출의 DNA에있는 장소 QIAquick 열입니다. 1 분 동안 서 보자. DNA를 용출하는 13,000 rpm에서 1 분간 원심 분리기. 45 ℃에서 DNA를 냉동 건조 를 Resuspend 10 μL 라벨 버퍼에 펠렛과 염료를 건드리지 않고 염료의 튜브에 추가합니다. 또 다른 10 μL 라벨 버퍼 반복합니다. 소용돌이와 염료 DNA의 튜브를 스핀 다운. 알루미늄 호일로 튜브를 포함하고 레이블을 RT O / N에 어두운 곳에서 보관하십시오. QIAquick 염기 제거 키트 프로토콜을 반복합니다. 두 개의 차이점 수행 – 프로브에 200 μL PN 버퍼를 추가하고 열 배를 통해 표시된 프로브를 넣어. – 용출 전에 무소속 염료를 씻어하기 위해 버퍼 PE 3 세척을 수행합니다. AF터 용출은 Nanodrop 분광을 통해 농도를 얻을 수 있습니다. 라벨 효율은 일반적으로 단일 가닥 DNA의 ~ 0.25 pmol의 / NG입니다. 3. coverslip을 준비 플라즈마 부리로 가지런 히 진공 챔버 (의 슬라이드에 배치 coverslips는 http://www.plasmapreen.com/ ) (더 중심 가까이). 전자 레인지에 진공 챔버 넣어 봉인되어 있는지 확인합니다. 펌프를 켜고는 먼저 펌프가 시작되고 한 번 진공 청소기의 전원을 켭니다. 전자 레인지를 켜고 플라즈마 표시 후 5 초를 중지합니다. 펌프 후 진공을 해제합니다. 진공 챔버를 당겨 집게 (추락 한 사람들은 다시 청소해야합니다)와 coverslips를 제거합니다. 장소는 12 – 웰 플레이트의 세척면을 위로하여 coverslips를. 4. 고정 절차 최소한 미디어의 주위에 0.1-0.2의 OD 600 효모 성장. 세포를 10 ml의 충분한 FO를 얻을 수R ~ 10 별도의 교잡. 성장 미디어 (문화의 10 ㎖ + 1 ML 37 % 포름 알데히드)에 직접 1 / 10 부피 37 % 포름 알데히드를 추가하고 45 분 동안 앉아 보자. microcentrifuge 관 (1 분간 13,000 rpm으로 회전 수) 1 ML 얼음 차가운 버퍼 B와 배 씻는다. spheroplasting 버퍼 1 ML을 추가합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 대부분의 세포 (즉, 위상 밝은하지 않음) 검정 때까지 세포에게 현미경으로 몇 분마다 확인합니다. 저속 (~ 3,500 RPM)에서 회전, 차가운 얼음 버퍼 B와 배 씻는다. 70 % 에탄올 1 ML을 추가 부드럽게 resuspend을 4에서 하룻밤 남겨 ° C (-20 ° C에서 무한정 저장할 수 있습니다.) 5. 하이브리드 절차 하이브리드 솔루션을 준비 : 하이브리드 버퍼 100 μL에, 그 프로브의 1-3 μL, 소용돌이와 원심 분리기를 추가합니다. 가수 프로브는 프로브 세트 당 8-10 NG 총 (즉, 당 유전자)를 사용합니다. 우리는 3 DIF와 동시에 3의 유전자까지 몇 군데있다ferent 표시된 프로브 설정합니다. 을 열기 전에 실내 온도에 하이브리드 솔루션을 따뜻하게해야합니다. 스텔라리스 프로브를 들면, 그것은 1 μL 1:10 각각 1:20, 1:50 한 최적 확인할 수있는 프로브 1:100 희석 작업을 추가하여 4 별도의 혼성화 반응을 시작하는 것이 좋습니다. 스텔라리스 프로브의 작업을 희석는 하이브리드 버퍼에 준비가되어 있습니다. 원심 분리기 (모든 후속 단계, 3,500 RPM, 5 분) 고정 세포 (예를 들어, 200 μL)와 에탄올을 멀리 대기음. 부드럽게 하이브리드 버퍼와 같은 비율 포름 아미드를 포함 1 ML 세척 버퍼에 resuspend을. 2-5 분 동안 서 보자. 샘플 및 대기음 세척 버퍼를 원심 분리 한 후 하이브리드 솔루션을 추가합니다. 부드러운 흔들림과 어둠 속에서 품어, 37 O / N ° C. 참고 : 다음 절차의 coverslips에 / 영상 셀을 적용합니다. W에 대한참조 다른 반응성 산소 종 헤매다 솔루션을 포함한 96 – 웰 플레이트에 / 영상 세포를 애슁 http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols합니다. 다음 날, 또는 사전에 깨끗한 (절차 참조) 5 분 150 μL 0.01 % 폴리-L-라이신과 커버 전표를 처리합니다. 흡입, dH보다 2 O와 배 세척하고 건조시켜 건조 할 수 있습니다. 아침, 샘플 세척 버퍼 1 ML을 추가 부드럽게 resuspend을, 원심 분리기 및 대기음 후, 30 분 동안 37 ° C에서 세척 버퍼와 부화의 또 다른 1 ML에 resuspend을. 2X SSC + 0.1 % 셰이커에 대한 RT에서 트리톤 X-100 15 분 씻어. 그것은 설치하기 전에 RT까지 올 수 있도록 냉동고 매체를 장착보십시오. 셰이커에 RT 15 분에 1X SSC로 세척. PBS (0.1 ㎍ / ㎖) 최종 150 μL의 세포를 resuspend에 DAPI를 희석. 청소 / 폴리리스 – trea 위에 자리 솔루션12 잘 플레이트 테드 커버 전표, 최소 30 분 그대로. 용액을 제거 (당신은 백업으로 여분의 커버 슬립에 배치 할 수 있습니다) 1 ML 1X PBS로 3 배 씻는다. 슬라이드 (Invitrogen 사 P36934)에 골드 설치 매체를 연장 3 μl를 놓습니다. 당신이 매체를 마운트의 건조 방지하기 위해 여러 커버 전표가있는 경우라도이 하나를 수행합니다. 핀셋으로 잡고 12 – 웰 플레이트에 coverslip을 위해 ~ 0.5 ML의 에탄올을 추가 건조 커버 슬립과 공기를 제거합니다. 매체를 마운트에 슬립 세포 쪽 덮개를 아래 어둠 속에서 강화 몇 시간 또는 O / N하자 놓습니다. 매니큐어 가장자리를 밀봉 이미지로 이동합니다. 6. 올림푸스 IX-81 거꾸로 현미경 개요와 세포 이미징 이미지 수집을 위해 우리는 Slidebook (지능형 imaging.com) 소프트웨어와 100X, 1.45 NA, TIRFM 오일 목적을 사용합니다. 크로마 필터 세트 (시약 참조) 시리얼 GFP, DAPI, CY3, Cy3.5와 Cy5에 이미징을위한. DAPI 필터를 사용찾아 세포에 초점을 맞 춥니 다. 참조 점으로이 설정합니다. 총 거리 0.2 μM의 크기 (25 평면)과 5 μM 인 참조 점을 중심으로 이미지의 Z – 스택을 가져 가라. 각 염료 채널 (즉, 각 프로브 세트)에 대해이 단계를 반복합니다. 이미지 분석을위한 16 비트 TIFF로 내보낼 수 있습니다. 7. 이미지 분석 개요 (가수 프로브) 아래 우리는 우리가 MATLAB에서 물고기 이미지를 분석에 사용할 계산 방법의 개요를 제공합니다. 사용 관련 MATLAB 함수는 오른쪽 괄호 있습니다. 알고리즘과 임계 값은 현재 가수 스타일의 프로브에서 데이터를 조정합니다. 스텔라 스타일의 프로브를 사용하면 특히 최종 필터링 단계 (7.8)에 약간의 조정이 필요합니다. 셀 식별 15 DAPI 이미지 16 글로벌 임계 값을 사용하여 배경에서 별도 세포 [graythresh]. 확장 최대 값 함수에게 [메신저를 사용하는 핵을 식별extendedmax]. 유역 알고리즘 씨앗 같은 핵을 사용하여 세그먼트 세포 [유역]. 각각의 형광 채널 반점 찾기 배경을 정상화하고 잡음 비율로 신호를 개선하기 위해 tophat 변환을 수행 [bwmorph]. 각 장소에 대한 포커스에있는 레이어 (Z-평면)을 식별하는 최대 값 찾기 [imregionalmax]. 방사형 그라디언트에 선형 피팅 모델을 사용하여 잠재적 인 장소를 필터링합니다. 측정 지점의 강도 및 필터 하나 대 다수의 프로브 신호 이전에 발견에 초점 레이어와 추정 강도 17 자리로 2D 가우시안 프로파일을 맞 춥니 다. 임계 값 (히스토그램 기반)을 사용하여 약점을 필터링합니다. 가수 형 프로브의 경우이 중요하지만, 스텔라리스 프로브 덜 수 있습니다. 각 셀에 지점을 계산합니다.