Summary

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

Published: April 14, 2013
doi:

Summary

Cette procédure donne des neurones télencéphaliques en passant par les points de contrôle qui sont similaires à ceux observés au cours du développement humain. Les cellules peuvent se différencier spontanément, sont exposés à des facteurs qui les poussent vers la lignée neuronale, sont isolés et sont étalées sur des lamelles couvre-objet pour permettre une différenciation terminale et de maturation.

Abstract

Ici, une procédure par étapes pour générer efficacement télencéphaliques neurones glutamatergiques de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) a été décrite. Le processus de différenciation est déclenchée par la rupture des CPP de l'homme en touffes qui complètent pour former des agrégats lorsque les cellules sont placées dans une culture en suspension. Les agrégats sont ensuite cultivées dans un milieu de CSEh jours 1-4 pour permettre une différenciation spontanée. Pendant ce temps, les cellules ont la capacité de devenir l'une des trois feuillets embryonnaires. De 5-8 jours, les cellules sont placées dans un milieu d'induction neurale pour les pousser dans la lignée neuronale. Autour jour 8, les cellules sont autorisés à fixer sur plaque de 6 puits et de se différencier au cours de laquelle la forme des cellules neuro-épithéliale. Ces cellules neuro-épithéliales peuvent être isolés au jour 17. Les cellules peuvent ensuite être conservé sous forme de neurosphères jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être étalées sur des lamelles. L'utilisation d'un milieu de base sans aucun facteur de caudalizing, les cellules neuro-épithéliales sont précisésd télencéphaliques en précurseurs, qui peuvent ensuite être davantage différenciées en progéniteurs télencéphaliques dorsales et les neurones glutamatergiques efficacement. Dans l'ensemble, notre système offre un outil pour générer des neurones glutamatergiques de l'homme pour les chercheurs d'étudier le développement de ces neurones et les maladies qui les affectent.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (CISP), ont la capacité de produire tous les types de cellules dans le corps, y compris les neurones 1-3. Différenciation dirigée des différents sous-types neuronaux du PSC de l'homme détient la clé de l'application de ces cellules en médecine régénérative. La génération des sous-types neuronaux fonctionnels au cours du développement est un processus complexe impliquant l'induction de la lignée neuronale, la spécification des progéniteurs régionales le long de l'axe rostro-caudal, et la différenciation des types de neurones post-mitotiques des progéniteurs régionaux 4,5. A partir de 2001, plusieurs systèmes ont été mis en place pour générer des lignées de CSEh neurones, qui ont fourni une plate-forme pour la génération suivante de sous-types neuronaux 6,7. Basé sur les principes de développement, les types de neurones plusieurs comme la colonne vertébrale neurones moteurs 8-12, mésencéphale dopneurones aminergiques 13-15, les cellules rétiniennes neuronales 16,17 ont été efficacement spécifié dans les CSP de l'homme. Cela a été fait en appliquant morphogènes essentiels qui sont importants pour la spécification de ces types de neurones au cours du développement in vivo. D'autres protocoles ont également été élaborées pour promouvoir la différenciation des CSEh dans les neurones en utilisant soit des facteurs supplémentaires tels que les 18-20 petites molécules ou par co-culture avec d'autres types cellulaires pour aider à promouvoir la différenciation 21.

Le néocortex humain est très développé et contient de nombreux types cellulaires, y compris les neurones glutamatergiques qui jouent un rôle important dans l'apprentissage, la mémoire et la fonction cognitive 22,23. La première étape pour générer des neurones glutamatergiques dans la culture est de spécifier des cellules progénitrices télencéphaliques. Groupe de Yoshiki Sasai le premier signalé la différenciation dirigée des précurseurs télencéphaliques de la souris CES (mESCs) en utilisant une suspensio sans sérumn culture en présence de DKK1 (qui inhibe la signalisation Wnt) ainsi que LeftyA (qui inhibe la signalisation nodal) 24. Par la suite, plusieurs groupes, dont le nôtre ont également signalé la spécification des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme dans le sérum 25-27 milieu exempt. La génération des précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme n'exige pas l'utilisation de morphogènes exogènes et l'efficacité dans la production de ces précurseurs est beaucoup plus élevé que celui de mESCs 26,27. Ici, un système chimique définie pour l'induction neurale qui a été bien établi par le groupe de Zhang 7 a été décrite. Sans l'ajout de facteurs exogènes caudalizing, ce protocole génère efficacement les précurseurs télencéphaliques du PSC de l'homme 27. Ces progéniteurs peuvent alors se différencier en progéniteurs dorsales ou ventrales en régulant la signalisation de Wnt et sonic hedgehog (SHH). Les progéniteurs dorsaux peuvent en outre se différencier en neurones glutamatergiques efficiently 27. En outre, ce protocole fonctionne aussi bien pour la génération de neurones glutamatergiques de l'homme iPSCs 28, qui permet de générer des neurones spécifiques du patient qui peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d'action ainsi que des thérapies potentielles pour un large éventail de maladies . De plus, notre système offre également une plate-forme pour explorer le développement et la spécification des divers types de neurones dans le télencéphale.

Protocol

1. Génération des agrégats cellules souches pluripotentes humaines (D1 à D4) Cellules souches pluripotentes humaines sont mises en culture sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) alimentateurs en présence d'un milieu additionné de CSEh facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, 4 ng / ml). Après 5-7 jours de culture, lorsque les colonies sont grandes, mais encore indifférencié, ils sont prêts pour la prochaine étape. La solution enzymatique doit d'abord être…

Representative Results

Ici, un protocole de différencier les CSP de l'homme dans télencéphaliques neurones glutamatergiques au travers de plusieurs étapes essentielles: la formation d'agrégats de la CFP, l'induction de cellules neuro-épithéliales, la production de progéniteurs télencéphaliques et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones télencéphaliques (Figure 1) a été décrits. Ce système est robuste et efficace dans la production de progéniteurs des neurones glutamatergique…

Discussion

Il ya plusieurs étapes importantes au cours du processus de différenciation neurale. Il est important de s'assurer que les CSP sont pluripotentes humaines car, sinon, les cellules peuvent déjà être biaisée en vue de devenir une lignée non neuronales. Cela peut être confirmé par coloration des CSP de l'homme avec des anticorps contre les marqueurs de pluripotence comme Oct4, Sox2, Nanog, et Tra-1-60 1-3. Si les guichets de l'homme n'attache pas très bien après les passages, inhibiteu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Y. Sasai pour avoir généreusement fourni l'anticorps FOXG1. Ce travail a été soutenu par des subventions souches Connecticut recherche sur les cellules (08-SCB-UCHC- 022 et 11-SCB24) et la Fondation paraplégie spastique.

Materials

Reagent Supplier Catalog #
Dulbecco’s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercaptoethanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai  
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9” glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation  
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company  
Centrifuge (5702 R) Eppendorf  

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

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Cite This Article
Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

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