مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة
Summary
هذا الإجراء ينتج الخلايا العصبية الدماغ الانتهائي من خلال الذهاب من خلال نقاط التفتيش التي هي مماثلة لتلك التي لوحظت خلال التنمية البشرية. يسمح للخلايا للتمييز بشكل عفوي، ويتعرض لعوامل التي تدفع بهم نحو النسب العصبية، ومعزولة، وعلى ومطلي coverslips للسماح التمايز النهائي والنضج.
Abstract
هنا، وقد وصفت إجراء تدريجي لتوليد الخلايا العصبية بكفاءة الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة (الأمنية). وبدأت عملية التمايز عن طريق كسر الأمنية الإنسان في كتل التي محاصرة لتشكيل المجاميع عند وضع الخلايا في ثقافة التعليق. ثم تزرع في وسط المجاميع hESC من أيام 1-4 ليسمح لتمايز عفوية. خلال هذا الوقت، والخلايا لديها القدرة على التحول إلى أي من الطبقات الجرثومية الثلاث. من أيام 5-8، وتوضع الخلايا في وسيلة تحريض العصبية لدفعهم إلى نسب العصبية. حول يوم 8، ويسمح للخلايا لوحات تعلق على 6 جيدا وتفرق خلالها خلايا عصبية ظهارية شكل. يمكن عزل هذه الخلايا الظهارية العصبية في يوم 17. ويمكن بعد ذلك أن تبقى الخلايا كما neurospheres حتى جاهزة للمطلي على coverslips. باستخدام وسيلة أساسية دون أي عوامل منشئ للذنب، وخلايا عصبية ظهارية هي specifieد السلائف في الدماغ الانتهائي، والتي يمكن بعد ذلك أن يفرق الى مزيد من الأسلاف الدماغ الانتهائي الظهرية والخلايا العصبية الجلوتاميرجي بكفاءة. وعموما، نظامنا يوفر أداة لتوليد الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الإنسان للباحثين لدراسة تطوير هذه الخلايا العصبية والأمراض التي تؤثر عليهم.
Introduction
الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs)، لديها القدرة على توليد كل نوع من الخلايا في الجسم، بما في ذلك الخلايا العصبية 1-3. تمايز الخلايا العصبية الموجهة من الأنواع الفرعية المختلفة من شركات الأمن الخاصة الإنسان هو مفتاح لتطبيق هذه الخلايا في الطب التجديدي. توليد الخلايا العصبية الوظيفية الأنواع الفرعية خلال التنمية عملية معقدة تنطوي على تحريض النسب العصبية، مواصفات الأسلاف الإقليمية على طول محور rostro-الذيلية، والتفريق بين أنواع الخلايا العصبية بعد الإنقسامية من الأسلاف الإقليمية 4،5. ابتداء من عام 2001، تم إنشاء عدة أنظمة لتوليد نسب العصبية من hESCs، التي وفرت منصة للجيل اللاحق للأنواع فرعية العصبية 6،7. استنادا إلى المبادئ التنموية، وأنواع الخلايا العصبية عديدة مثل الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري 8-12، DOP الدماغ المتوسطالخلايا العصبية aminergic 13-15، وخلايا الشبكية العصبية 16،17 تم تحديد كفاءة من الإنسان الأمنية الخاصة. وقد تم ذلك من خلال تطبيق morphogens الحرجة التي تعتبر هامة لتحديد هذه الأنواع خلال الخلايا العصبية في الجسم الحي التنمية. كما تم وضع بروتوكولات أخرى لتعزيز التفريق بين الخلايا العصبية في hESCs باستخدام عوامل إضافية مثل 18-20 جزيئات صغيرة أو عن طريق زراعة بالتعاون مع أنواع الخلايا الأخرى للمساعدة في تعزيز التمايز 21.
ودرجة عالية من التطور والقشرة المخية الحديثة الإنسان يحتوي على العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية التي الجلوتاميرجي تلعب دورا هاما في التعلم، والذاكرة، والإدراك وظيفة 22،23. الخطوة الأولى في توليد الخلايا العصبية في الثقافة الجلوتاميرجي هو تحديد الخلايا الاصلية الدماغ الانتهائي. مجموعة يوشيكي Sasai لاول مرة في المفاضلة الموجهة السلائف الدماغ الانتهائي من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس (mESCs) باستخدام المصل خالية suspensioن الثقافة في وجود DKK1 (الذي يثبط إشارات WNT) وكذلك LeftyA (الذي يثبط إشارات العقدي) 24. في وقت لاحق، وأفادت عدة مجموعات من بينها وفدنا أيضا مواصفات السلائف من الدماغ الانتهائي الأمنية الإنسان في المصل 25-27 المتوسطة الحرة. الجيل السلائف من الدماغ الانتهائي الأمنية الإنسان لا تتطلب استخدام morphogens الخارجية وكفاءة في توليد هذه السلائف أعلى من ذلك بكثير من mESCs 26،27. هنا، وقد وصفت نظام محدد كيميائيا لتحريض العصبية التي أنشئت بشكل جيد من قبل مجموعة تشانغ 7. بدون إضافة عوامل خارجية منشئ للذنب، يولد هذا البروتوكول بكفاءة السلائف من الدماغ الانتهائي الأمنية الإنسان 27. ويمكن بعد هذه الأسلاف تكون متباينة في ظهري أو بطني الأسلاف من خلال تنظيم الإشارات من القنفذ سونيك WNT و(SHH). أسلاف الظهرية يمكن التفريق الى مزيد من الخلايا العصبية ه الجلوتاميرجيfficiently 27. وبالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول أيضا يعمل بشكل جيد لتوليد الخلايا العصبية الجلوتاميرجي من iPSCs الإنسان 28، والذي يسمح لتوليد المريض محددة الخلايا العصبية التي يمكن استخدامها لاستكشاف آلية العمل وكذلك العلاجات المحتملة لمجموعة كبيرة من الأمراض . وعلاوة على ذلك، لدينا نظام يوفر أيضا منصة لاستكشاف التنمية وتحديد أنواع الخلايا العصبية في الدماغ الانتهائي متنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال عملية التمايز العصبية. من المهم للتأكد من أن الإنسان متعددة الإمكانات الأمنية الخاصة لأنه قد سبق وإلا فإن الخلايا تكون متحيزة نحو التحول إلى نسب غير العصبية. ويمكن التأكد من ذلك عن طريق تلطيخ الأمنية الإنسان مع أجسام مضادة ضد علام?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Y. Sasai بسخاء لتوفير الأجسام المضادة FOXG1. وأيد هذا العمل من قبل الجذعية أبحاث الخلايا المنح كونيتيكت (08-SCB-UCHC- 022 و 11 SCB24-) والشلل النصفي التشنجي مؤسسة.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalog # |
| Dulbecco’s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 |
| 2-Mercaptoethanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| N2 | Gibco | 17502-048 |
| B27 | Gibco | 12587-010 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 |
| FBS | Gemini | 100-106 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 |
| Dispase | Gibco | 17105-041 |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | |
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 |
| 15 ml tubes | BD | 352097 |
| 6 well plates | BD | 353046 |
| 24 well plates | BD | 353047 |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 |
| 9” glass pipetes | Fisher | 13-678-20D |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | |
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | |
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
- Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
- Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
- Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
- Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
- Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
- Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
- Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
- Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
- Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
- Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
- Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
- Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
- Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
- Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
- Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
- Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
- Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
- Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
- Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
- Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
- Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
- Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).
