De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic
Summary
El seguimiento de las células utilizando MRI ha ganado la atención notable en los últimos años. Este protocolo describe el etiquetado de las células dendríticas con flúor (<sup> 19</sup> Partículas F)-ricos, la aplicación in vivo de estas células, y para determinar el alcance de su migración a los ganglios linfáticos de drenaje con<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H RMN y<sup> 19</sup> F MRS.
Abstract
Continuos avances en las técnicas de imagen no invasivas, como la resonancia magnética (RM) han mejorado en gran medida nuestra capacidad para estudiar los procesos fisiológicos o patológicos en los organismos vivos. Resonancia magnética también está demostrando ser una herramienta valiosa para la captura de las células trasplantadas in vivo. Iniciales estrategias de etiquetado celulares para uso MRI hecho de agentes de contraste que influyen en los tiempos de relajación MR (T1, T2, T2 *) y conducen a una mejora (T1) o agotamiento (T2 *) de señal en la que están presentes las células marcadas. T2 * Agentes de mejora tales como agentes ultrapequeñas de óxido de hierro (USPIO) se han empleado para estudiar la migración celular y algunos también han sido aprobados por la FDA para su aplicación clínica. Un inconveniente de los agentes de T2 * es la dificultad de distinguir la extinción de la señal creada por las células marcadas de otros artefactos, como coágulos de sangre, hemorragias micro o burbujas de aire. En este artículo se describe una nueva técnica para el seguimiento de las células in vivo queestá basada en el etiquetado de las células con flúor (19 F)-partículas ricas. Estas partículas se preparan mediante emulsión de perfluorocarbono (PFC) y compuestos entonces se utiliza para marcar células, que posteriormente se pueden obtener imágenes por resonancia magnética F 19. Ventajas importantes de PFC para el rastreo de células in vivo incluyen (i) la ausencia de carbono enlazado a 19 F in vivo, lo que proporciona entonces libres fondo-imágenes y completo de células selectivityand (ii) la posibilidad de cuantificar la señal de la célula por espectroscopía 19 F MR .
Introduction
El rastreo de las células in vivo es un aspecto crucial en varios campos de la biomedicina. Para ello, las técnicas de imagen no invasivas que selectivamente puede localizar células en un período de tiempo son extremadamente valiosos. Antes del desarrollo de tres dimensiones de imágenes de resonancia magnética (MRI), el seguimiento de la migración de células inmunes se limitan a los análisis microscópicos o biopsias de tejidos. Seguimiento de la célula con la ayuda de resonancia magnética ha ganado la atención inmenso en los últimos años, no sólo para los inmunólogos que estudian el comportamiento celular inmune in vivo, sino también para los investigadores clínicos y de células madre. Durante mediados de los 90, los primeros estudios sobre el óxido de nanopartículas de hierro 1 inició una cascada de acontecimientos para que las células de seguimiento con IRM. Partículas de óxido de hierro acortar el tiempo de relajación MR (T2 *) de las células marcadas y por lo tanto causar el agotamiento de la señal en imágenes de RM. Partículas de óxido de hierro se han empleado para la etiqueta 2 macrófagos, p oligodendrocyterogenitors 3 y muchos otros tipos celulares. Algunas de estas partículas también han sido clínicamente aprobado por la FDA para el etiquetado de vacunas celulares en 4 pacientes con melanoma. Dado que in vivo o ex vivo etiquetado de las células con partículas de óxido de hierro se basa en un acortamiento de la señal * T2 y el segundo podría ser también provocada por in vivo relacionados con la susceptibilidad-T2 * efectos tales como hemorragias, micro depósitos de hierro, o burbujas de aire, podría ser difícil de identificar células marcadas in vivo de fondo otro T2 * extinciones de señal 5.
En este artículo, se describe una técnica para el seguimiento de las células dendríticas (DC) in vivo mediante el empleo de 19 F / 1 H formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Esta tecnología de rastreo celular se introdujo en 2005 6, varios años después de las primeras aplicaciones reconocidas para 19 F en la RM se habían notificado 7. Una importante Advantage de 19 F sobre el etiquetado de óxido de hierro de células de partícula es la baja aparición biológica de 19 F en el tejido, lo que hace posible el seguimiento de las células de forma muy selectiva con imágenes básicamente libres de fondo-. Además, es posible superponer la señal de MR 19 F a partir de las células trasplantadas etiquetados con imágenes anatómicas obtenidas de RM convencional 1H. 19 F / 1 H RMN es por lo tanto considerablemente relevantes para los estudios que investigan la migración celular in vivo. Células estudiadas con este método se etiquetan con 19 F-partículas ricas. Perfluorocarbonos sintéticamente derivados (PFC) que consisten principalmente de carbono y átomos de flúor se utiliza comúnmente para preparar las partículas. Estos compuestos son insolubles en agua y deben ser emulsionado antes de la aplicación in vitro o in vivo. El tamaño habitual de las partículas de PFC que han sido empleados por otros grupos en vivo 19 F-RMN experimentos de seguimientooscila entre 100 nm y 245 nm 6,8-10. Sin embargo, hemos demostrado que la eficiencia en el etiquetado de las células dendríticas con perfluoro-15-corona-5-éter (PFCE) las partículas aumenta con el aumento del tamaño de partícula (> 560 nm). 11
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método de emplear 19 F / 1 H RMN para seguir el desplazamiento de CC en el nodo de linfa ofrece la oportunidad de estudiar los patrones de migración de las células inmunes in vivo. Las células dendríticas son excelentes ejemplos de la rápida migración de las células inmunes que son capaces de maniobrar a través de las estructuras tridimensionales sin fuertemente adherido a sustratos específicos 17. Aunque la baja resolución espacial (rango de micras) de la técni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SW (DFG WA 2804) y una beca universitaria a SW en el Centro de Investigación Experimental y Clínica, una colaboración del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular y la Facultad de Medicina Charité de Berlín. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, recogida de datos y análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito. Agradecemos al Sr. Robert Westphal para el apoyo técnico durante su internado en nuestro laboratorio.
Materials
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA |
References
- Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
- Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
- Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
- de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
- Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
- Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
- Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo “hot spot” MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
- Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
- Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
- Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
- Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
- Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
- Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
- Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes – a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
- Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
- Haacke, E. M. . Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).
