Summary

I mitocondri associati Membrane ER (MAMs) e glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM): Isolamento dal cervello di topo

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.

Abstract

Organelli intracellulari sono strutture altamente dinamiche con diversa forma e composizione, che sono sottoposti a stimoli intrinseci ed estrinseci delle cellule-specifiche. Le loro membrane sono spesso giustapposti a siti di contatto definiti, che diventano centri per lo scambio di molecole di segnalazione e dei componenti della membrana 1,2,3,4. Le inter-organelli microdomini di membrana che si formano tra il reticolo endoplasmatico (ER) ei mitocondri all'apertura del IP3-sensibili Ca 2 + sono noti canali come i mitocondri associato-ER membrane o MAMS 4,5,6. La proteina / lipide composizione e le proprietà biochimiche di questi siti di contatto di membrana sono stati ampiamente studiati in particolare in relazione al loro ruolo nella regolazione intracellulare Ca 2 + 4,5,6. La ER serve come fonte principale di Ca 2 + intracellulare, e in questa capacità regola una miriade di processi cellulari a valle di Ca 2 + segnalazione, including post-traduzionale folding delle proteine ​​e proteine ​​maturation7. Mitocondri, invece, mantenere l'omeostasi Ca 2 +, tamponando citosolico Ca 2 + concentrazione impedendo così l'apertura di percorsi apoptotici a valle di Ca 2 + squilibrio 4,8. La natura dinamica delle MAMs li rende luoghi ideali di base per analizzare i meccanismi cellulari, tra cui Ca 2 + di segnalazione e regolazione di mitocondriale Ca 2 + sopravvivenza concentrazione, la biosintesi dei lipidi e dei trasporti, il metabolismo energetico cellulare e 4,9,10,11,12. Diversi protocolli sono stati descritti per la purificazione di questi microdomini di tessuto epatico e cellule coltivate 13,14.

Assunzione di metodi precedentemente pubblicati in considerazione, abbiamo adattato un protocollo per l'isolamento dei mitocondri e MAMs dal cervello di topo adulto. Per questa procedura, abbiamo aggiunto un ulteriore passaggio di purificazione, cioè un estrazione Triton X100, che enables l'isolamento del glicosfingolipide arricchito microdomini (GEM), frazione dei MAMs. Queste preparazioni GEM condividere componenti proteiche diverse con zattere caveolae e lipidi, derivati ​​dalla membrana plasmatica o altre membrane intracellulari, e si propone di funzionare come la raccolta punti per il raggruppamento delle proteine ​​recettori e per interazioni proteina-proteina 4,15.

Protocol

Il seguente protocollo è stato progettato per l'isolamento e la purificazione di MAMs e gemme da cervello di topo Soluzioni richiesto per l'isolamento di mitocondri, MAMs e gemme Frazionamento per ottenere greggio preparazione mitocondriale: Soluzione A: 0,32 M saccarosio, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2 + inibitori delle proteasi (aggiungere fresco, se necessario)…

Representative Results

Sulla base della nostra esperienza con l'utilizzo di questo protocollo possiamo tranquillamente lo consiglio per l'isolamento e la purificazione di MAMs, gemme e frazioni mitocondriali di cervello di topo. La procedura indicata è altamente riproducibile e coerente. In figura 1 si mostra una immagine rappresentativa dello strato modo puro mitocondri e MAMs su un gradiente Percoll (passo 3.4). A definito, banda lattiginoso contenente purificata mitocondri (Mito-P) segrega al fondo del tubo ultrac…

Discussion

I siti di contatto tra membrane intracellulari o tra organelli e la membrana plasmatica di cellule rappresentano dinamiche piattaforme di segnalazione per processi cellulari di base. La caratterizzazione accurata della loro funzione e la composizione sia in condizioni fisiologiche e patologiche richiede protocolli di purificazione affidabili e riproducibili. I metodi qui descritti sono stati specificamente ottimizzate dal nostro laboratorio per l'isolamento e la purificazione dei MAMs e loro gemme corrispondenti del…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo il contributo di Renata Sano nel concepire il protocollo iniziale. Ad'A. detiene le Jewelers per i bambini (JFC) Dotato Cattedra di Genetica e terapia genica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da sovvenzioni NIH GM60905, DK52025 e CA021764, e gli americani libanesi Charities siriane associati (ALSAC).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

References

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Cite This Article
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

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