בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן הזהב<em> במבחנה</em> מערכת ללמוד את המעבר של תאי לווין ברגיעה, הפעלה והתמיינות. חשוב מכך, מערכת תרבות myofiber אחת שומרת על קשר תא myofiber / גזע, שהוא מרכיב חיוני בנישה של תאי הגזע בשרירים.
התחדשות שרירים במבוגרים מתבצעת על ידי תאי גזע תושבים נקראים תאי לווין. תאי לווין מוגדרים לפי עמדתם בין lamina הבסיס וsarcolemma של כל myofiber. ידע הנוכחי של ההתנהגות שלהם מסתמך במידה רב על השימוש בפרוטוקול בידוד myofiber האחת. בשנת 1985, בישוף תאר פרוטוקול לבודד סיבים חיים בודדים מflexor digitorum רוויס (FDB) של חולדות בוגרות במטרה ליצור במערכת מבחנה שבהתאחדות הפיסית בין myofiber ותאי הגזע שלה נשמרה 1. בשנת 1995, Rosenblattmodified פרוטוקול הבישוף כאלה שmyofibers נקטף ומטופלים בנפרד ביחידים לאחר עיכול collagenase במקום להיות מבודד על ידי הכח הכביד שקיעת 2, 3. רוזנבלט או בישוף הפרוטוקול מאז הותאם לשרירים שונים, גיל או תנאי 3-6. טכניקת בידוד myofiber היחידה היא הכרחיתכלי בגלל היתרונות הייחודיים שלה. ראשית, בפרוטוקול myofiber היחיד, תאי לווין נשמרים מתחת lamina הבסיס. זוהי תכונה ייחודית של הפרוטוקול כטכניקות אחרות כגון מיון תא הופעל פלואורסצנטי דורשות כימיות ומכאנית רקמה 7 דיסוציאציה. למרות שמערכת תרבות myofiber לא יכולה להוות תחליף למחקרי vivo, זה להציע פלטפורמה מצוינת כדי לטפל במאפיינים ביולוגיים רלוונטיים של שריר בתאי גזע. myofibers היחיד יכולה להיות מתורבת בתנאי ציפוי סטנדרטיים או בתנאים משתנים. תאי לווין על myofibers הצף נתונים לכמעט שום השפעה אחרת מאשר סביבת myofiber. קשיחות מצע וציפוי הוכחו להשפיע על היכולת של תאי לווין להתחדש שרירי 8, 9 באופן עצמאי להיות מסוגל לשלוט בכל הגורמים הללו מאפשר אפליה בין תגובות נישה תלויה ועצמאיות. ריכוזים שונים של סרום ליגם הוכח יש השפעה על המעבר מרגיעה להפעלה. כדי לשמר את מצב הרגיעה של תאי לווין הקשורים אליו, סיבים צריכים להיות כל זמן במדיום סרום נמוך 1-3. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר בודקות את הגנים מעורבים במצב הרגיעה. במדיום עשיר סרום, תאי לווין להפעיל במהירות, מתרבה, נודד ולהבדיל, ובכך מחק בתהליך התחדשות vivo 1-3. המערכת יכולה לשמש לביצוע מגוון של מבחנים כגון בדיקה של מעכבים כימיים; ביטוי אקטופי של גנים על ידי משלוח וירוסים; גן oligonucleotide המבוסס עקום למטה או הדמיה חייה. מאמר וידאו זה מתאר את הפרוטוקול המשמש כיום במעבדה שלנו לבודד myofibers הבודד מLongus extensor digitorum (אדי) השרירים של עכברים בוגרים (6-8 שבועות).
הבידוד והתרבות של myofibers הבודד משרירים שלמים מספקים מצוין במודל מבחנה כדי ללמוד את התהליך של התחדשות שריר. תכונה ייחודית של מערכת זו היא השמירה על תאי לווין בסביבה הפיזיולוגית שלהם מתחת lamina הבסיס. והכי חשוב, טכניקה יכולה לשמש כדי לחקור התנהגות תאי גזע שריר בשתי מדינות הופעלו רגיעה ול. במהלך 20 השנים האחרונות, מערכת תרבות myofiber ספקה תובנה משמעותיות לביולוגיה של אוכלוסיית תאי הלווין ביחס לשני גורמים פנימיים וחיצוניים. על ידי myofibers הבודד culturing, הטרוגניות תא לווין ביחס לmyofiber, סוג שריר או פוטנציאל משובים טופלה 15. מחקרים משוכללים באמצעות הדמית חיה של סיבי תרבית יחידים מותרים למידע צובר בדפוס נדידת תאי לווין 16. הרכישה של נתונים כמותיים היאסימפוני אפשרי. אמנם זמן רב, הוא מספק מידע משמעותי על ההפצה וההתרחשות של אירועים ספציפיים (תאי גזע סימטרי יחס חלוקה, שגשוג והתמיינות, וכו '). יחד עם יישומים שתוארו קודם לכן, חלבון או RNA חילוץ מסיבים בודדים הוא גם אפשרי, למרות בידודה של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין על ידי FACS או באמצעים אחרים עלול לספק פלטפורמה טובה יותר כדי לחקור שינויי ביטוי חלבון או גן ברמה מולקולרית. מניסיוננו, השלב הקריטי ביותר לבידוד סיבים מוצלחים הוא "הגיד לגיד" בידוד (שלבים 2.5-2.9 בטקסט הפרוטוקול). זה מבטיח שלאחר עיכול שריר, סיבים משתחררים מהאד עם ניזק מינימאלי או ללא הגדלת הביצועים שלהם ובכך בשלבים הבאים.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לשרה דיק למתן קריאה והערות ביקורתיות. MAR הקתדרה לחקר גנטיקה מולקולרית בקנדה והוא תלמיד מחקר בינלאומי של הווארד יוז הרפואי במכון. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לMAR מהמכונים הלאומיים לבריאות, הווארד יוז הרפואי במכון, המכון הקנדי לחקר בריאות, אגודה לניוון שרירים ותכנית מחקר קתדרת קנדה.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |