肌纤维的分离和培养是黄金标准<em在体外</em系统研究通过平静,激活和分化的过渡卫星细胞。重要的是,单个肌纤维的文化系统保留的肌纤维/干细胞协会,这是一个必不可少的组成部分的肌肉干细胞小生境。
肌肉再生的成人进行的居民称为卫星细胞的干细胞。卫星细胞被定义为他们的基底层之间的位置和每个肌纤维的肌膜。目前的知识,他们的行为在很大程度上依赖于使用的单个肌纤维隔离协议。比肖夫于1985年,描述了一个协议,来隔离从成年大鼠趾短屈肌(FDB)的目标是建立在体外系统中,肌纤维和其干细胞之间的物理缔合被保留1单活纤维。 1995年,Rosenblattmodified比肖夫协议单独挑选和处理,使肌纤维分开后,胶原酶消化,而 不是孤立的重力沉降2,3。罗森布拉特或比肖夫协议已经被调整到不同的肌肉,年龄或条件3-6。单肌纤维隔离技术是不可缺少的工具,由于其独特的优势。首先,在单肌纤维协议,卫星细胞保持下面的基底层。这是一个独特的功能,协议,其他如荧光激活细胞分选技术要求化学和机械组织分离。虽然肌纤维的文化系统无法代替的体内研究,它提供了一个很好的平台,以解决有关的肌肉干细胞的生物学特性。单肌纤维的培养可以在标准的镀敷条件下或在浮动条件。卫星细胞上浮动肌纤维的比肌纤维的环境,几乎没有其他影响。基材的刚度和涂层已被证明影响卫星细胞的能力,再生肌肉8,9,以便能够独立地控制每个这些因素允许利基依赖性和独立反应的区分。不同浓度的血清也被证明有效果上从静止过渡激活。为了保持其相关联的卫星细胞的静止状态,纤维应保持在低血清培养基中1-3。研究基因在静止状态时,这是特别有用的。在血清营养丰富的培养基中,卫星细胞迅速激活,增殖,迁移和分化,从而模拟体内再生过程中的 1-3。该系统可用于执行各种的检测,如测试的化学抑制剂;提供由病毒的基因的异位表达;寡核苷酸为基础的基因敲除或实时成像。此视频文章介绍了目前使用的协议,在我们的实验室分离出单个肌纤维的趾长伸肌(EDL)肌肉成年小鼠(6-8周龄)。
单从完整的肌肉的肌纤维的分离和培养提供了一个极好的体外模型研究的过程中,肌肉再生。该系统的一个独特的功能是保存的卫星细胞的生理环境下的基底层。最重要的是,该技术可用于研究在两个静止和活化的状态的肌肉干细胞的行为。在过去的20年中,肌纤维培养系统提供了有意义的见解,卫星细胞的生物学人口与内在和外在的决定因素。通过培养个人的肌纤维,卫星细胞的异质性肌纤维,肌肉型或再生的潜力已经解决15。精心研究使用的单一培养的纤维允许卫星细胞迁移模式16获得信息的实时成像。的定量数据的采集是一个莱索托。虽然费时的,它提供了显着的分布和发生特定事件(干细胞不对称分裂,增殖和分化比等)的信息。与先前描述的应用程序一起,从单纤维是蛋白质或RNA的提取也可以,虽然隔离通过FACS或其他装置的卫星细胞的纯人口调查蛋白质或基因的表达,在分子水平上的变化,可能提供一个更好的平台。根据我们的经验,成功的光纤隔离最关键的一步是“筋筋”隔离(在协议文本的步骤2.5至2.9)。这可以保证,肌肉消化后,纤维被释放与最小或没有损害,从而提高它们的性能在下面的步骤从EDL。
The authors have nothing to disclose.
我们想感谢萨拉·迪克提供批判性阅读和评论。 MAR持有加拿大研究主席,分子遗传学和霍华德休斯医学研究所是一个国际研究学者。这项工作得到了国家卫生研究院,霍华德休斯医学研究所,加拿大卫生研究院的研究,肌肉萎缩症协会和加拿大研究主席计划拨款,MAR。
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |