Summary

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Published: October 29, 2012
doi:

Summary

Lo sviluppo di optogenetics ora fornisce i mezzi per stimolare i neuroni geneticamente definiti con precisione e circuiti, sia<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em>. Qui si descrive il montaggio e l'impianto di una fibra ottica per fotostimolazione cronica del tessuto cerebrale.

Abstract

Modelli chiarire di connettività neuronale è stata una sfida sia per clinica e di base delle neuroscienze. Elettrofisiologia è stato il gold standard per l'analisi dei modelli di connettività sinaptica, ma accoppiati registrazioni elettrofisiologiche possono essere sia ingombrante e sperimentalmente limitante. Lo sviluppo di optogenetics ha introdotto un metodo elegante per stimolare i neuroni e circuiti, sia in vitro che in vivo 1 e 2,3. Sfruttando cellula-tipo di attività specifica promotore per guidare l'espressione opsin in discrete popolazioni di neuroni, si può stimolare con precisione geneticamente definiti sottotipi neuronali distinti circuiti 4-6. Metodi ben descritti per stimolare neuroni, compresi stimolazione elettrica e / o manipolazioni farmacologiche, sono spesso del tipo cellulare indiscriminata, invasivo, e può danneggiare i tessuti circostanti. Queste limitazioni possono alterare la normale funzione sinaptica e / o di comportamento del circuito. Inoltre, a causaalla natura della manipolazione, i metodi attuali sono spesso acuta e terminale. Optogenetics offre la capacità di stimolare i neuroni in modo relativamente innocuo, e nei neuroni geneticamente mirati. La maggior parte degli studi riguardanti optogenetics in vivo attualmente utilizza una fibra ottica guidato attraverso una cannula impiantata 6,7, tuttavia, le limitazioni di questo metodo includono tessuto cerebrale danneggiato con inserimento ripetuto di una fibra ottica, e una possibile rottura della fibra all'interno della cannula. Dato il campo in rapida crescita della optogenetics, un metodo più affidabile di stimolazione cronica è necessaria per facilitare studi a lungo termine con il minimo danno tissutale collaterali. Qui forniamo il nostro protocollo modificato come video articolo per integrare il metodo efficace ed elegantemente descritto in Sparta et al. 8 per la realizzazione di un impianto in fibra ottica e la sua fissazione permanente sul cranio di topi anestetizzati, così come l'assemblaggio del fibraaccoppiatore ottico collega l'impianto di una fonte di luce. L'impianto, collegato con fibre ottiche ad un laser a stato solido, permette un metodo efficiente per photostimulate cronicamente funzionale circuiteria neuronale con danno tissutale meno 9 utilizzando piccoli, staccabili, cavezze. Fissaggio permanente degli impianti in fibra ottica provvede a mantenere a lungo termine in vivo studi optogenetic di circuiti neuronali in Svegliatevi, topi si comportano 10 con minimo danno tissutale.

Protocol

* Tutti i materiali insieme a rispettivi produttori e / o fornitori sono elencati di seguito il protocollo. 1. Assemblaggio di impianto Preparare una miscela di calore epossidica induribile fibra ottica aggiungendo 100 mg di catalizzatore a 1 g di resina. Misurare e tagliare circa 35 mm di 125 micron in fibra ottica da 100 micron nucleo segnando con un cuneo scriba punta in metallo duro. Posizionare la perpendicolare scriba alla fibra ottica e punteggio in un unico movim…

Discussion

Optogenetics è una tecnica nuova e potente che consente il controllo senza precedenti su specifici sottotipi neuronali. Ciò può essere sfruttato per modulare circuiti neurali con precisione anatomica e temporale, evitando il tipo cellulare e indiscriminata effetti invasivi di stimolazione elettrica attraverso un elettrodo. L'impianto di fibre ottiche permette di coerenza, stimolazione cronica dei circuiti neurali più sessioni in sveglio, comportandosi topi con il minimo danno al tessuto. Questo sistema, originar…

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere che questa tecnica è stata originariamente descritta da Sparta et al., 2012 ed è stato facilmente adattato per l'uso nel nostro laboratorio.

Materials

Name of the Reagent or Equipment Company Catalogue # Comments
LC Ferrule Sleeve Precision Fiber Products (PFP) SM-CS125S 1.25 mm ID
FC MM Pre-Assembled Connector PFP MM-CON2004-2300 230 μm Ferrule
Miller FOPD-LC Disc PFP M1-80754 For LC ferrules
Furcation tubing PFP FF9-250 900 μm o.d., 250 μm i.d.
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-1270 127 μm ID Bore
MM LC Stick Ferrule 1.25 mm PFP MM-FER2007C-2300 230 μm ID Bore
Heat-curable epoxy, hardener and resin PFP ET-353ND-16OZ  
FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk ThorLabs D50-FC For FC ferrules
Digital optical power and Energy Meter ThorLabs PM100D Spectrophotometer
Polishing Pad ThorLabs NRS913 9″ x 13″ 50 Durometer
Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits ThorLabs LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P  
Standard Hard Cladding Multimode Fiber ThorLabs BFL37-200 Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool ThorLabs T10S13 Clad/Coat: 200 μm / 300 μm
SILICA/SILICA Optical Fiber Polymicro Technologies FVP100110125 High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA
1×1 Fiberoptic Rotary Joint doric lenses FRJ_FC-FC  
Mono Fiberoptic Patchcord doric lenses MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC  
Heat shrink tubing, 1/8 inch Allied Electronics 689-0267  
Heat gun Allied Electronics 972-6966 250 W; 750-800 °F
Cotton tipped applicators Puritan Medical Products Company 806-WC  
VetBond tissue adhesive Fischer Scientific 19-027136  
Flash denture base acrylic Yates Motloid ColdPourPowder+Liq  
BONN Miniature Iris Scissors Integra Miltex 18-1392 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades
Johns Hopkins Bulldog Clamp Integra Miltex 7-290 1-1/2″(3.8 cm), curved
MEGA-Torque Electric Lab Motor Vector EL-S  
Panther Burs-Ball #1 Clarkson Laboratory 77.1006  
Violet Blue Laser System CrystaLaser CK473-050-O Wavelength: 473 nm
Laser Power Supply CrystaLaser CL-2005  
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20  
Probe Fine Science Tools 10140-02  
5″Straight Hemostat Excelta 35-PH  
Vise with weighted base Altex Electronics PAN381  

References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
  3. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
  4. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  5. Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
  6. Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  7. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
  8. Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
  9. Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
  10. Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).

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Cite This Article
Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue. J. Vis. Exp. (68), e50004, doi:10.3791/50004 (2012).

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