Summary

В Vivo Imaging Systems (ИВИС) Обнаружение Нейро-инвазивная Вирус энцефалита

Published: December 02, 2012
doi:

Summary

Используя люциферазы и в естественных систем визуализации (ИВИС) в качестве нового средства выявления заболевания до появления клинических конечных точках события происходят. ИВИС позволили нам визуализировать в реальном времени вторжения вирусов энцефалита в течение нескольких дней, обеспечивая более точное заболевание моделью для будущих исследований. Это также позволило нам выявить потенциальные защитные свойства противовирусных препаратов и вакцин быстрее, чем в настоящее время применяются животных моделях. Возможность использования отдельных животных в течение нескольких моментов времени обеспечивает уменьшить животное требований, затрат и общей заболеваемости на животных использовались обеспечения более гуманного и более научными средствами болезни исследовании.

Abstract

Современные достижения в области технологий визуализации способствовать дальнейшему развитию и совершенствованию на пути вирусных исследований выполнена. Первоначально предложенный Расселом и Burch в 3Rs Юма (замена, восстановление, уточнение), использование животных моделей в научных исследованиях находится под постоянным давлением для выявления новых методологий для уменьшения использования животных при одновременном повышении научной точностью и скоростью. Одна из основных задач для директора Юма, однако, в том, как обеспечить исследования являются статистически точным при одновременном снижении животных заболеваемости и общего числа. Исследования Эффективность вакцины в настоящее время требуют большого количества животных для того, чтобы считать статистически значимым и часто приводит к высокой заболеваемости и смертности конечные точки для определения иммунной защиты. Мы использовали в естественных систем визуализации (ИВИС) в сочетании с ферментом светлячков биолюминесцентного постепенно отслеживать вторжения в центральной нервной системе (ЦНС) по ENCEphalitic вируса в мышиной модели. Как правило, болезнь протекает относительно медленно, однако репликация вируса происходит быстро, особенно в ЦНС, и может привести к часто летальный исход. После интраназального заражения мышей с TC83-Luc, ослабленный венесуэльского конского энцефалита штамма вируса изменены, чтобы выражает гена люциферазы, мы находимся в состоянии представить себе репликации вируса в мозг по крайней мере за три дня до развития клинических симптомов заболевания. Используя CNS вторжением в качестве ключевой энцефалита конечной точкой развития болезни мы в состоянии быстро определить терапевтическую вакцину и защиты от TC83-Люк инфекции до появления клинических симптомов. С технологией ИВИС мы можем продемонстрировать быстрое и точное тестирование препарата терапии и вакцин при одновременном сокращении численности животных и заболеваемости.

Protocol

1. Подготовка животных Животное прибытия: По прибытию на уровень животного биобезопасности 2 (ABSL2) объектов, позволяют животным не менее 2 дней, чтобы привыкнуть к новой среде. После этого периода отдыха, осмотра животных, чтобы оценить их здоровья и общего физического облика. П…

Representative Results

С генетически модифицированный вирус, TC83-люциферазы, мы увидели увеличение биолюминесцентного сигнала, как репликация вируса перемещается из области носа в центральной нервной системы (рис. 1). В связи с высокой вирусной скоростью репликации, мы ожидаем, что высокие уровни био…

Discussion

Хотя этот протокол охватывает аспекты изображений для прижизненного анализа, важно признать биолюминесцентного вектор как ключевой фактор для будущих исследований. Наши использования TC83, ослабленный штамм вакцины VEEV, в качестве вектора для экспрессии люциферазы гарантирует, чт…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Институт Поступательное наук UTMB-NIH грант 1UL1RR029876-01 и Алиша Пратер за ее помощь в редактировании видео для этой рукописи.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
D-Luciferin
Isoflurane
Xenogen IVIS System (Spectrum) Caliper Life Sciences
XGI-8-gas Anesthesia System Caliper Life Sciences
XIC-3 Containment Box Caliper Life Sciences
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences
Telemetry/identification chips Bio Medic Data Systems IPTT-300 Animal ID and Temperature
BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle Fisher Scientific 305279
Vet Bond tissue adhesive Fisher Scientific NC9259532
Vetropolycin Ophthalmic Ointment Webster Veterinary Products 78444656
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X Invitrogen 14190-144
BMDS Chip Reader Bio Medic Data Systems DAS-7007S
DAS-HOST Software Bio Medic Data Systems Used to download probe information

References

  1. Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
  2. Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
  3. Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
  4. Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
  5. Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
  6. Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
  7. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
  8. Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
  9. Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
  10. Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
  11. Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
  12. Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).

Play Video

Cite This Article
Poussard, A., Patterson, M., Taylor, K., Seregin, A., Smith, J., Smith, J., Salazar, M., Paessler, S. In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus. J. Vis. Exp. (70), e4429, doi:10.3791/4429 (2012).

View Video