Enumerazione delle popolazioni dei leucociti del sangue periferico per le principali studi clinici multicentrici utilizzando un intero saggio Fenotipizzazione Sangue

Nota: per proteggere i fluoroforo anticorpi coniugati dalla luce, eseguire tutte le fasi di un bio-Armadio di sicurezza con la luce spenta.

1. Antibody colorazione Preparazione del pannello

1. Il pannello colorazione anticorpo può essere trovato in Tabella 1. Concentrazione di anticorpi dovrebbe essere definita mediante titolazione con sangue intero e utilizzando la stessa attrezzatura citometria di flusso e le procedure che saranno utilizzati per acquisire i campioni fenotipizzazione macchiati.
2. Una volta che i titoli di colorazione adeguati sono determinati, unire tutti gli anticorpi in una miscela unica in un lock-tappo del tubo. Aggiungere tampone di lavaggio flusso (Dulbecco PBS con 2% di siero fetale bovino inattivato) per portare il volume totale di 100 microlitri. Scala la miscela per il numero di campioni che colorati. Questa miscela può essere conservato a 4 ° C per un massimo di otto settimane.

2. Colorazione

1. Se il sangue raccolto deve essere utilizzato per altri scopi in annunciodizione di questo saggio, impostare una aliquota parte mentre più sensibili al tempo procedure sono eseguite il sangue residuo. L'aliquota può essere conservato a temperatura ambiente per 4 ore dopo l'iniezione in vena senza significativa perdita di cellule.
2. Verificare che non vi è un intatto tallone pellet sul fondo del tubo Trucount ed etichetta il tubo per identificare il campione viene macchiato. Negli studi clinici HVTN, il Laboratorio di Data Management System (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) è usato per etichettare e tenere traccia dei campioni colorati.
3. Registrare i numeri di lotto e le date di scadenza di tutti i reagenti. Registrare il numero di conteggio Trucount tubo cordone fornito dal produttore sulla borsa di tubi, assicurarsi che il numero di lotto sulla borsa corrisponde al numero di lotto sul tubo.
4. Utilizzare pipettaggio inverso per pipettare esattamente 100 pl di sangue intero nella provetta Trucount, appena sopra il fermo metallico. Evitare sbavature di sangue lungo il lato del tubo.
Tabella 1) nel tubo Trucount. Tappare la provetta e vortex a bassa velocità per circa 15 secondi per mescolare. Ispezionare visivamente il tubo per garantire che il pellet tallone è completamente sciolto.
5. Incubare la provetta Trucount per 15 minuti a temperatura ambiente (15-30 ° C) al buio.
6. Se necessario, diluire una aliquota di 10 × soluzione FACS Lisi a 1X con DIH ₂ O. Aggiungere 900 microlitri 1 × soluzione FACS Lisi al tubo.
7. Tappare la provetta e agitare bene a bassa velocità per circa 15 secondi per mescolare. Spingere verso il basso il tappo saldamente in posizione di bloccaggio sul tubo e sigillare con la pellicola di laboratorio.
8. Conservare il tubo a -65 ° C a -95 ° C fino a quando il campione è pronto per la spedizione al laboratorio di analisi centrale o per analisi in casa. I campioni sono stabili in questa fase per almeno quattro settimane. Se la spedizione o il saggio immediatamentetamente, questo passaggio può essere omesso.

3. Spedizione

Nota: Le istruzioni che seguono utilizzano un sistema di trasporto isolato da Saf-T-Pak, Inc. idoneo alla spedizione categoria B sostanze biologiche esenti secondo la International Air Transport Association e (IATA). Se l'analisi dei campioni nella stessa posizione come la colorazione si è verificato, andare alla sezione 4.

1. I campioni possono essere spediti immediatamente dopo colorazione o una volta che sono congelati a -65 ° C a -95 ° C. Avvolgere ogni tubo completamente in pellicola e mettere in casella campione macchiato. Posizionare la scatola macchiato campione all'interno di una tenuta poli-borsa con materiale assorbente.
2. Posizionare la tenuta poly-bag e contenuto in un sacchetto di Tyvek e sigillare con meno aria possibile nel sacchetto.
3. Posizionare il pacchetto campione (campione all'interno imballaggio secondario) all'interno della scatola interna marrone.
4. Posizionare l'interno marrone bbue all'interno del torace polistirolo, fissandolo nella dentellatura per evitare che si spostino.
5. Riempire la cassa in polistirolo con ghiaccio secco (circa 8 kg) e posizionare il coperchio a tenuta sul petto.
6. Nastro saldamente il contenitore di spedizione e la nave come sostanza biologica, Categoria B (UN3373) con il ghiaccio proprio a secco (UN1845) le marcature; seguire IATA PI-650 istruzioni.
7. Al ricevimento, i campioni vengono conservati a -65 ° C a -95 ° C fino a che vengono analizzati.

4. Scongelamento e Citometria a Flusso analisi

1. Togliere il campione macchiato dal freezer a scongelare a temperatura ambiente al buio prima di raccogliere il citofluorimetro. Se la raccolta di dati su più di un campione, standardizzare il processo per tutte le provette sfalsando scongelamento modo che i tubi non sono seduti a temperatura ambiente per più di 1 ora ciascuno.
2. I campioni devono essere acquisiti utilizzando un citofluorimetro quattro laser dotato di filtri adatti, come il BD LSRII. Utilizzare standard di calibrazione citometro e metodi di compensazione fluorescenza per i dati di raccolta ^4.

Nota: Non impostare soglie scatter scatter in avanti o di lato durante la raccolta ^5. Perline Trucount può scendere al di sotto della soglia impostata più basso possibile per questi parametri che causano un sottoinsieme di perline di non essere contabilizzati durante l'analisi. Se richiesto dallo strumento di fissare una soglia, impostare il più basso possibile Am Ciano soglia canale. Perché leucociti CD45 ⁺ colorati con il pannello sarà Am Ciano positivo, e perline Trucount anche fluorescenza nel Ciano Am canale, ciò dovrebbe consentire di tutti i dati pertinenti devono essere opportunamente raccolti.

3. Agitare la provetta per 5 secondi prima di caricare sul citofluorimetro. Perline Trucount reagiscono molto in molti canali. Porta le perle al momento della raccolta, trovando la popolazione che è altamente doppio positivo per Cy5 PE e APC (i due colors che più facilmente distinguere le perle dalle celle può variare a seconda strumentazione). Selezionare la porta tallone come arresto del cancello, e registrare i dati fino a quando almeno 20.000 perle vengono acquisiti.
4. Analizzare i dati utilizzando un software appropriato, come FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Figura 1 mostra lo schema di gating utilizzata per l'analisi delle diverse popolazioni leucocitarie da un pareggio rappresentante sangue di controllo.

5. Calcoli Trucount

1. Ogni tubo Trucount contiene un pellet liofilizzato di perline fluorescenti. Dopo l'aggiunta di liquido al tubo e di vortex, le perle dovrebbe diventare equamente distribuiti in tutto il campione. Il numero di perle in pellet varia leggermente da lotto e si trova sulla custodia per i tubi.
2. Porta le perline Trucount e delle popolazioni di cellule, come mostrato in Figura 1 per determinare i conteggi di eventi per ogni popolazione. Confrontando il numero di eventi in il cancello tallone al numero totale di perline originariamente nel tubo consente di determinare il rapporto di campione prelevato, che può quindi essere utilizzato per determinare la concentrazione assoluta (cioè cellule / mL) per ogni popolazione. La seguente equazione può essere utilizzato per questo scopo: La concentrazione cellulare (# cellule / pl sangue intero) = [# di popolazione (eventi / eventi / # # perlina perline totali in pellet)] / 100 ul.

6. Risultati rappresentativi

Figura 1. Regime Soppressione utilizzato per l'analisi delle principali popolazioni leucocitarie che mostrano i dati rappresentativi di un volontario sano. A) perline Trucount (i) sono gated ed esclusi dalle cellule. Granulociti (ii) sono delineati e lympohcytes e monociti sono divisi in 3 popluations: CD14linfociti negativi (iii), tutte le cellule CD14 negative (iv), e non-linfociti (v). B) CD14 linfociti negativi sono gated per distinguere cellule T CD4 + (vi), cellule T CD8 + (vii), cellule B (viii), CD56 cellule luminose NK (ix), CD56 cellule dim NK (x), e CD56 cellule negative NK (xi). C) Tutte le cellule CD14 negative sono gated distinguere mieloide (xii) e plasmacitoidi (xiii) cellule dendritiche. D) non-lympocytes sono gated di distinguere non classici (xiv), intermedi (xv), e classica (xvi) monociti. Clicca qui per ingrandire la figura .

Sottopopolazioni cellulari più specifiche che non sono mostrati nella Figura 1 (ad esempio, cellule NKT o neutrofili) può anche essere distinti utilizzando il pannello presentiamo, e lo schema di gating può essere esteso o modificato per soddisfare esigenze specifiche di studio. Alcuni passi gating indicati sono unici a questo metodo. Di particolare nota, un cancello inclusione ecancello esclusione rimangono attorno alle perline Trucount e posti uno sopra l'altro, uno per cancello per contare le perline, e uno di escludere le perline dall'analisi cellulare (Figura 1A). Inoltre, poiché i linfociti, monociti e granulociti non sono così facilmente distinguibili nel sangue intero in quanto sono nelle cellule mononucleari del sangue periferico da scatter in avanti e laterale scatter, gating queste cellule con CD45 espressione e side scatter è spesso necessario (Figura 1A). Granulociti contaminanti (cerchio) che non potevano essere separati da linfociti e monociti con CD45 e side scatter si distinguono in alcuni appezzamenti per la loro alta espressione CD16 (Figura 1C e 1D Figura). Il numero di granulociti contaminanti è generalmente piccolo, e non interferiscono con gating monociti e cellule NK.

In questo rapporto, presentiamo una perlina metodo basato per l'enumerazione di popolazioni leucocitarie in sangue fresco intero mediante citometria di flusso e coprire i parametri necessari per il suo utilizzo in uno studio clinico multicentrico, con l'analisi del campione centralizzata. Questo metodo si basa su e ottimizza il protocollo BD Trucount e consente il suo utilizzo affidabile in un ambiente clinico multicentrico. Il saggio colorazione è semplice e richiede circa 45 minuti per eseguire, rendendo così possibile la sanguigni tecnici di laboratorio di elaborazione di eseguire e di congelare e trasferire i campioni ad un laboratorio di analisi centrale per l'analisi. Il test richiede solo 100 pl di sangue intero, che elimina la necessità di tempo e costose elaborazione PBMC e utilizza un volume molto inferiore saggi fenotipizzazione standard. Inoltre, utilizzando sangue fresco intero, questo dosaggio più accuratamente descrive la in stato vivo delle cellule ed elimina gli effetti dannosi di crioconservazione osservati su qualche tipo di cellulas ^1-3. Questo metodo di colorazione produce misurazione accurata della concentrazione cellulare, ma con il vantaggio di distinguere tipi cellulari molto maggiori rispetto ai metodi di conteggio CBC e altri. La chiave per ottenere risultati accurati e coerenti è quello di uniformare con attenzione i passaggi critici del protocollo e di utilizzare un sistema di documentazione che tiene traccia di tutti i passaggi in modo che eventuali anomalie che vengono scoperti possono essere ricondotte alla fonte dell'errore.

Ci sono diversi passaggi critici durante il processo che influenzano la qualità dei dati acquisiti da questo test. Primo, la standardizzazione del trattamento e manipolazione del sangue dal tempo viene disegnata con il tempo è macchiato è importante, simile a quanto riportato in precedenza per PBMC elaborazione ^6. Otteniamo dati coerenti quando il sangue viene memorizzato nei tubi di raccolta nel sito clinico e trasportato ai laboratori di lavorazione a temperatura ambiente, la colorazione èeseguita entro 4 ore di prelievo di sangue, ed i campioni colorati vengono poi spediti in ghiaccio secco al laboratorio analisi centrale. Inoltre, rendendo il cocktail di anticorpi presso il laboratorio centrale e inviarlo ai laboratori di trasformazione del sito, che garantisce la coerenza tra i siti e può testare ogni cocktail su un prelievo di sangue di controllo prima di essere utilizzato per colorare campioni di prova. È importante che il laboratorio di analisi centrale standardizzare questo processo. Pertanto si raccomanda che una volta che gli anticorpi costituenti vengono titolati per ottimizzare la separazione tra le popolazioni positive e negative ^7, lo stesso lotto di anticorpo da utilizzare per la colorazione di tutti i campioni in un trial clinico di mantenere costanti i livelli di colorazione per ciascun marcatore. Se questo non è possibile (ad esempio, la mancanza di disponibilità da un produttore anticorpo), ogni nuovo lotto di anticorpi devono essere opportunamente titolata per garantire che i dati di citometria a flusso sarà paragonabile a quello ottenuto con il lotto precedente. Il laboratorio centrale edel laboratorio sito deve fare molta attenzione per spedire e conservare il cocktail di anticorpi a 4 ° C ed evitare l'esposizione alla luce per ridurre al minimo il degrado che può verificarsi, in particolare con coloranti tandem ^8-9.

La precisione dei dati acquisiti con questo saggio dipende da diversi passaggi critici durante la procedura di colorazione e di acquisizione dei campioni sul citofluorimetro. Di particolare nota, pipettaggio inverso accurata del sangue nel tubo Trucount è essenziale; una piccola differenza di volume del sangue potrebbe avere un grande effetto sulle concentrazioni calcolate di sottopopolazioni cellulari. Vortex a bassa velocità dopo aver aggiunto il cocktail di anticorpi e BD FACS lisare per mescolare completamente i reagenti è importante. Analogamente, vortex accuratamente per erogare le perline uniformemente il campione prima acquisizione è essenziale per un corretto conteggio ^10. Lievi variazioni nelle impostazioni di analisi sul citofluorimetro può anche avere un forte impatto sui dati acquisiti, in modo da caReful attenzione dovrebbe essere prestata alla taratura e la configurazione del citometro con l'uso quotidiano ^4.

Va inoltre osservato che, mentre i dati preliminari suggeriscono che il congelamento dei campioni macchiati non sembrano influenzare le concentrazioni cellulari ottenute (dati non mostrati), questo deve ancora essere testato a fondo. Anche se questo è un problema potenziale, il confronto tra i campioni possono comunque essere effettuate con fiducia fino a quando tutti i campioni sono gestiti in modo coerente.

Monitoraggio attento per tutta la colorazione del campione e l'analisi è particolarmente importante, soprattutto quando centinaia di campioni vengono trattati nel contesto di una sperimentazione clinica. Una volta che i dati sono acquisiti e analisi iniziata, è fondamentale standardizzare cancelli analisi il più possibile tra i campioni. Alcuni variabilità nella fluorescenza di alcune popolazioni possono verificarsi, in particolare tra i volontari diversi, ma luoghi di gate standard, dovrebbe essere impostato che sono applicabilicavo di campioni possibili. Qualsiasi spostamento delle porte dalla posizione standard deve essere documentata e presi in considerazione per determinare se i cambiamenti nella conta delle cellule si verificano tra i campioni.

Questo metodo di colorazione è stato ottimizzato per enumerare i leucociti sottoinsiemi principali utilizzando un pannello di anticorpi colorazione, ma la procedura e il pannello potrebbe essere facilmente modificato per soddisfare esigenze specifiche di studio. Contrariamente a quanto Trucount scheda tecnica procedura, che suggerisce di utilizzare 50 microlitri di sangue, il metodo che presentiamo utilizza 100 ul. Utilizzando un volume di sangue più grande, più eventi possono essere acquisite nel corso di analisi, che è utile quando si studia popolazioni cellulari con concentrazioni relativamente basse nel sangue periferico, come le cellule dendritiche. Anche se gli studi precedenti hanno enumerato popolazioni di cellule dendritiche attraverso Trucount con 50 pl e 100 volumi di sangue ul ^11-12, i rapporti indicano che ragionevole precisione dipende l'acquisizione di almeno 400 positivposta eventi popolazione, e questo spesso può essere difficile con le cellule dendritiche quando si utilizza solo il 50 microlitri di sangue ^13. Il volume di sangue utilizzato può essere ulteriormente regolata per soddisfare le esigenze di analisi di specifici tipi cellulari o pannelli di colorazione. Allo stesso modo, il pannello colorazione potrebbe essere modificato per concentrarsi su alcuni tipi di cellule, permettendo così l'enumerazione di più sottoinsiemi di cellule specifiche al momento non si distinguono per il pannello mostrato qui (ad esempio, ulteriori sottoinsiemi di cellule NK o di cellule T regolatorie). L'uso di un singolo pannello semplifica il protocollo di colorazione e riduce gli errori associati pannelli multipli, quali errore di etichettatura di campioni macchiati. Sebbene l'uso di pannelli multipli aumenta i costi e il potenziale di errore, pannelli separati su misura per specifici tipi cellulari consentono fenotipizzazione più dettagliate e / o l'inserimento di marcatori di attivazione, e il loro uso può essere facilmente implementato in studi clinici multicentrici, tenendo conto le considerazioni precedentemente discoussed.

Tabella 1. Colorazione pannello di anticorpi per determinare tutte le principali popolazioni leucocitarie del sangue periferico.