Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Ein. IgG Isolation aus Patientenproben

1. Bereiten Mini-Immunadsorption Spalten, indem 3 ml anti-IgG-Sepharose pro 2 ml Patienten EDTA-Plasma in ein leeres Econo Pac Spalte. IgG Isolation erfordert mindestens 2 ml Patientenplasma.
2. Legen Sie einen Filter auf der Anti-IgG Sepharose, schnitt den unteren Spitze der Kolonne und drücken Sie die Filter, um eine Flussrate von ca. 1 Tropfen / sec erreichen. Lassen Sie die Konservierungslösung aus der Säule laufen.
3. Die Säule wird mit 3 Volumen 0,9% NaCl pro Volumen des Plasmas.
4. Pipettieren das Plasma auf der Säule. Wenn das Plasma vollständig in der anti-IgG Sepharose eingetaucht, mit dem gleichen Volumen 0.9% NaCl waschen.
5. Pipette ein Plasma-Volumen von 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,8 auf der Säule und lassen eintauchen in die Sepharose. Hinzufügen Volumen von Glycin-HCl auf die Säule. Sammeln des Durchflusses durch in einem 15 ml Röhrchen und den pH auf 7,3 mit 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
6. Um die Säule zu regenerieren, Mit 3 Plasmavolumen Glycin-HCl waschen. Nach einer letzten Waschung mit 2 Volumina 0,9% NaCl, kann die Säule für die nächste Plasmaprobe verwendet werden. Alternativ kann die Säule mit Konservierungslösung gefüllt werden und bei 4 - 8 ° C für bis zu 4 Wochen.
7. Für den Einsatz auf Kardiomyozyten hat die gesammelten IgG-Fraktion gegen experimentelle Puffer (EB) dialysiert werden. Für die Herstellung von EB, fügen Sie 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl _2, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,2 mM CaCl _2, 10 mM HEPES und 20 mM Glucose in 1 L destilliertem Wasser auf einem Magnetrührer und pH-Wert bis 7,3.
8. Füllen die IgG-Fraktion zu einem Celluloseester Dialysemembran Rohr mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100 kDa geschnitten. Legen Sie den Schlauch in 1 L EB und rühren langsam mit einem Magnetrührer bei 4 ° C. Nach 8 Stunden, übertragen Sie den Dialyseschlauch in 3 L von frischem EB und Dialyse für weitere 20 h bei 4 ° C.
9. Nach Dialyse, Hitze die Probe 30 min bei 57 ° C in einem Wasserbad auf inaktivierte Komplementfaktoren. Bestimmen Gesamt-IgG-Konzentration und bereiten Aliquots mit 330 ug IgG jeder. Beim Hinzufügen der Probe auf Kardiomyozyten für die Messung (Schritt 4,3), füllen die Aliquots zu 1 ml mit EB. Das unverwässerte Aliquots bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

2. Isolierung von Rattenkardiomyozyten

1. Zur Herstellung von Ca ^{2 +-freiem} Puffer Isolierung (IB), add 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM HEPES und 11 mM Glucose zu 1 l destilliertem Wasser mit Hilfe eines Magnetrührers Rührer. Der pH-Wert auf 7,4 bei Raumtemperatur und durch ein 0,2 um Flasche Top-Filter für die Sterilisation.
2. Füllen Sie 80 ml des IB in der oberen Reservoir einer thermostatisierten Langendorff-Perfusion System. Passen Thermostateinstellungen, um einen Puffer von 37 ° C zu halten und zu belüften Puffer mit 95% O _2/5% CO ₂ für 30 min.
3. Wiegen etwa 10.000 - 12.000 U collagenase Typ II, 175 mg fettsäurefrei BSA und in 20 ml IB mit 22,5 ul einer 100 mM CaCl ₂ Stammlösung aufzulösen. Steuerung des pH-Wertes des Puffers Isolierung in das obere Reservoir und bei Bedarf justieren.
4. Betäuben eine Wistarratten von 175 - 200 g mit 375 ug / kg Körpergewicht Thiopental. Fügen 2500 IU Heparin Thiopental Lösung. Nach Thorakotomie, Verbrauchssteuern Herzen vorsichtig mit einer intakten Aortenbogen und übertragen sie in eiskalter 0,9% NaCl. Reinigen des Herzens aus Blut und umgebendem Gewebe und Transfer zum frischen 0,9% NaCl. Setzen Sie die Aorta, öffnen Sie das Flow Reduzierer des Langendorff System ein Fallenlassen Geschwindigkeit 2-3/sec zu erhalten und befestigen Sie das Herz der Kanüle.
5. Perfundieren das Herz für bis zu 3 Minuten mit einer Flussrate von 1 Tropfen / sec auszuwaschen restlichen Blut. Start, um die IB in der Langendorff System zirkulieren. Entfernen 20 ml Puffer vom oberen Reservoir, in dem Kollagenaselösung und Nachfüllung soviel Puffer als erforderlich, um 80 ml zu erreichen füllen. Circulate die c ollagenase Lösung für weitere 27 min. Durchfluss sollte regelmäßig kontrolliert werden und bei 1 Tropfen / sec mit dem Flow Reduzierer gepflegt.
6. Lösen Sie das Herz aus der Kanüle, sauber von Atrien und Aorta und hacken in kleine Stücke schneiden. Lassen Sie die Kollagenaselösung in das untere Reservoir laufen, verringern Sie die Lautstärke auf ein Maximum von 40 ml und weitere verdauen die gehackten Ventrikel für 10 - 15 min unter ständiger Belüftung mit 95% O _2/5% CO _2. Anschließend filtern die Zellsuspension durch ein 200 um Maschenweite Gaze in ein 50 ml-Röhrchen.
7. Wiederherstellen der Ca ^{2 +-Gehalt} der Zellen in 3 Schritten: zentrifugieren Zellsuspension bei 43 xg für 2 min bei Raumtemperatur und resuspendieren Zellen in 10 ml IB mit 200 uM CaCl _2. Zentrifugieren und resuspendieren Zellen in 10 ml IB mit 500 uM CaCl _2. Nach einer letzten Zentrifugation resuspendieren Kardiomyozyten in sterilfiltriert EB (siehe 1.8) bis zu einer Dichte von 50.000 Zellen / ml.

1. Coat a 4 gut gekammert Deckglas mit 10 ug Laminin pro Vertiefung und warten, bis sie vollständig getrocknet ist.
2. Füllen 1 ml der Suspension in Kardiomyozyten jeder Vertiefung unter Verwendung einer Mikropipette mit einem Schnitt Spitze. Damit die Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu halten.
3. Verdünnen Sie 10 ul der 1 mg / ml Fura-2 AM Stammlösung in 5 ml EB. Halten Sie die Färbelösung im Dunkeln.
4. Take off Puffer und ungebundene Zellen aus dem Deckglas und Pipette 0,5 ml der Färbelösung in jedes Well. Inkubieren Sie die Zellen für 10 min unter mäßigem Schütteln. Anschließend nehmen Sie die Färbelösung, waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml EB und schließlich füllen 0,5 ml EB in jedes Well. Vermeiden Sie direktes Licht während der Färbung und immer die gefärbten Zellen im Dunkeln.

4. Recording of Cell Verkürzung und Ca ^{2 +} Transienten

1. Setzen Sie den Kammern Deckglas auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop microscope einem Myozyten Calcium und Kontraktilität Aufzeichnungssystem verbunden. Positionieren Sie eine maßgeschneiderte Elektrode mit einem Zustrom und Abfluss Rohr in die erste Vertiefung. Superfuse Kardiomyozyten mit 1 ml / min EB und starten Sie die elektrische Stimulation (20 V, 1 Hz, 5 ms Dauer). Damit die Zellen auf die Stimulation für ca. 2 min anzupassen.
2. Wählen Sie eine intakte stabförmigen Kardiomyozyten mit klaren Streifenbildung und ständige Kontraktion. Positionieren Sie die Zelle in der Mitte des Gesichtsfeldes und öffnen Sie die Kamera-Kanal. Orientieren Sie die Zelle horizontal im Video-Bereich durch Drehen der Zelle Framing-Adapter und das Bewegen des Mikroskops.
3. Passen Sie die Kantenerkennung Bedienelemente des Video-Bereich (Abbildung 2), öffnen Sie das fluoreszierende Kanal und Aufnahme von 10 bis 15 Kontraktionen, um die anfängliche Zellverkürzung und Ca ^{2 +} transiente erhalten.
4. Schließen Sie das Mikroskop Lichtkanal zu vermeiden Bleichen der Fluoreszenz Fleck. Schalten Sie den Strom durch von EB auf die ProbeBypass mit einem 3-Wege-Ventil und superfuse Kardiomyozyten mit 1 ml Patienten IgG. Stoppen Sie die Pumpe kurz vor Luft die auch erreicht.
5. Öffnen Sie den Lichtkanal und aufzeichnen weitere 10 bis 15 Kontraktionen der akuten Zell-Antwort zu erhalten. Die Aufnahme zu unterbrechen und schließen Sie den Lichtkanal wieder. Wiederholen Sie die Aufnahme nach 2 und 5 min.
6. Nehmen Sie die Elektrode aus dem Brunnen. Reinigen Sie die Rohre gründlich mit EB und fahren Sie mit der nächsten Vertiefung der Kammern Deckglas.
7. Analysieren Sie die Zellverkürzung und Ca ^{2 +} transient mit dem IonWizard Software mit dem "Edge-Length/Length" und die "Fura 2-Numeric abgezogen / Ratio"-Fenster sind. Berechnen der prozentualen Änderung von dem anfänglichen Zellverkürzung und Ca ^{2 +} Transienten der Peakhöhe bezogen auf den Ausgangswert (bl% Spitze h) für die akute, die 2 min und 5 min der Reaktion.

Zwei Beispiele für die Messung der zellulären Inotropie im Feld stimuliert adulten Kardiomyozyten (Abbildung 2) unter Verwendung eines Ca ^{2 +-Myozyten} und Kontraktilität Aufzeichnungssystem sind unten angegeben. Abbildung 3 gibt einen Eindruck einer Kontrollmessung, während in Figur 4 die Wirkung von Antikörpern kardiodepressiven eines Patienten mit DCM dargestellt.

In beiden Beispielen ersten Zellverkürzung und Ca ^{2 +} transient während Superfusion mit EB weisen deutliche und konstante Spitzen, was eine Voraussetzung für die Analyse. Wir wissen aus Erfahrung, dass Zellen, die eine erste bl% peak h im Bereich von 7 bis 14% Anzug am besten für unsere Anwendung, während Kardiomyozyten mit niedrigeren oder höheren anfänglichen Kontraktilität neigen oft dazu, provozierten Veränderungen Zellverkürzung aufweisen. Nach Anwendung der Kontroll-IgG, dh IgG von gesunden Kontrollpersonen isoliert bleibt Inotropie von Kardiomyozyten unchanged während der gesamten Messung (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu Superfusion mit IgG Antikörper enthält kardiodepressiven wird durch eine Abnahme der Zellverkürzung (4A), durch Reduktion Ca ^{2 +} Transienten gefolgt begleitet, die typischerweise weniger ausgeprägt ist (4B). Wir in der Regel feststellen, dass ein neuer stationärer Zustand für beide, Zellverkürzung und Ca ^{2 +-Transienten,} nach 2 min die bis zum Ende der Messung nach 5 min erhalten wird gegründet. Die gegebene Beispiel zeigt sehr deutlich negativ inotrope Wirkung mit einem Rückgang von Zellverkürzung um 54% und der Ca ^{2 +-Transienten} von 31% nach 5 min. Allerdings sind Veränderungen oft weniger ausgeprägt. Deshalb definierten wir eine obere und eine untere Grenze für negative und positive Inotropie als Mittelwert ± 2SD zur Kontrolle IgG einer gesunden Kontrollgruppe zu falsch positiven Ergebnissen zu vermeiden. Dementsprechend werden die Zellen nur als negativ oder positiv inotrope w alsHenne Veränderungen Zellverkürzung diese Schwelle überschreiten, die wir festgestellt, dass sie ungefähr ± 10%.

Abbildung 1. Flussdiagramm Autoantikörpernachweis durch Messung Kardiomyozyten Kontraktilität. Zunächst wird IgG aus Patientenproben mit anti-IgG Sepharose Säulen (gelb markiert) extrahiert. Zweitens sind Kardiomyozyten aus Rattenherzen durch enzymatische Verdauung und gefärbt mit Fura-2 (blau markiert) isoliert. Schließlich Zellverkürzung und Ca ^{2 +-Transienten} sind online über eine Myozyten Calcium und Kontraktilität Recording System (grün markiert) überwacht.

Abbildung 2. Isolierten Ratten Kardiomyozyten positioniert in der Video-Bereich der Myozyten Kontraktilität Recording System. Das untenstehende Diagramm der Zelle zeigt die berechnete Intensität Spuren zur Kantendetektion verwendet. Die Pfeile zeigen die Kantenerkennung Bedienelemente. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Repräsentatives Beispiel einer Kontrollmessung. Zellverkürzung (A) und Ca ^{2 +} transient (B) überwacht wurde online (initial) vor, unmittelbar (akut), 2 min und 5 min nach Superfusion mit IgG. Roten Linien zeigen die Messung angehalten.

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Abbildung 4. Beispiel Messung eines IgG enthaltenden Probe kardiodepressiven Antikörper. Zellverkürzung (A) und Ca ^{2 +} transient (B) gemessen wurde online vor (initial), sofort (akut), 2 min und 5 min nach Superfusion mit IgG. Roten Linien zeigen die Messung angehalten.

Die vorgestellte Methode bietet einen geeigneten Weg, um funktionell wirksame kardiale Autoantikörper bei Patienten mit DCM unklarer Herkunft zu erkennen. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie zB die Erfassung von funktionell aktiven Antikörper gegen den β1-Adrenozeptor durch ihre Auswirkungen auf die cAMP-Spiegel ^6, ist unsere Methode unabhängig von einem bestimmten Epitop. Selbstverständlich gibt es andere Epitop unabhängigen Assays in der Literatur beschrieben, dh Zählen der Schlagfrequenz von neonatalen Kardiomyozyten ^13, Messung Calcium Ströme in adulten Kardiomyozyten durch Patch-Clamp-Technik oder der Kontraktilität von isolierten Purkinje-Fasern ^14. In Vorteil dieser Verfahren ist der Assay hier vorgestellten weniger zeitaufwendig und bietet erhöhte Objektivität aufgrund der standardisierten Protokoll. Weiterhin ermöglicht es das Auftreffen auf die Kontraktilität und intrazellulären Calcium Transienten gleichzeitig.

Ähnlich otihrer in vitro-Assays, können die Ergebnisse mit dem vorgestellten Verfahren, das durch den künstlichen Bedingungen, die an die Zellen angefochten werden. Kultivierten neonatalen Rattenkardiomyozyten gemeldet wurden, um vorzugsweise zwischen befestigen Mikrosäulen mit einem Abstand von 30 um oder weniger als auf ebenen Substraten. Wenn an diesen befestigt wurden Zellen gefunden Aktin-Fasern anzuzeigen und ungeordnete Muskelfasern ^15. Die beschriebenen möglichen Auswirkungen von Stress Fasern in der Kontraktilität Assay kann hierbei vernachlässigbar, da adulten Kardiomyozyten nur für einen sehr kurzen Zeitraum von bis zu 6 Stunden, die die Bildung solcher Fasern und Zellverkürzung und Ca ^{2 +} reduzieren kann kultiviert transienten werden zur Vorlage Kontraktilität der jeweiligen Zelle, um den Einfluss der individuellen Unterschiede zwischen Zellen zu minimieren bezeichnet. Eine weitere Einschränkung ist die hohe Nachfrage von Versuchstieren und Zeit. Daher ist das Verfahren nicht geeignet ist für das Hochdurchsatz-Screening von patients.

Weitere Implementierungen sind denkbar für die Methode. Aufgrund der Antigen-Unabhängigkeit es kann auf andere idiopathischer kardiovaskulären Erkrankungen, wo eine Autoimmun Aufprall wird angenommen aufgebracht werden.

Außerdem kann Kontraktilität Messungen leicht angepasst werden, um eine funktionale Wirkung der anderen Substanzen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Analyse einer möglichen Auswirkungen von Medikamenten auf das Herz, was sich positiv zB sein kann in der Arzneimittelentwicklung und-prüfung. Neben den grundlegenden Parametern von den Veränderungen der Zell-Verkürzung und Ca ^{2 +} von der Grundlinie zur Verfügung gestellt, können weitere Informationen aus den Messungen, die eine genauere Definition des beobachteten Effekts erlaubt erzielt werden. Zum Beispiel kann der Abfahrt und Rückkehr Geschwindigkeit aus den Zellverkürzung Ereignisse, die einen bestimmten systolischen und diastolischen Wirkung eines Medikaments oder Antikörper geben konnte berechnet werden.