İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü
Summary
Sunulan yöntem izole sıçan kardiyomiyositlerde hücresel kısalma ve hücre içi kalsiyum geçici üzerinde izole hasta immunglobulin etkisini analiz ederek, bağımsız spesifik antijen, dilate kardiyomiyopatili hastaların plazmasında fonksiyonel etkin cardiotropic otoantikor saptamak için bir yol sunar.
Abstract
Dilate kardiyomiyopati (DKMP) genç yetişkinler 1 kalp yetmezliği için ana nedenlerinden biridir. Toksik maddelere genetik eğilim ve fuar hastaların yaklaşık üçte birinde bu hastalığın nedenleri bilinmesine rağmen, DCM kökeni büyük ölçüde belirsizdir. Bu hastaların önemli bir kısmında, kardiyak epitoplara otoantikorların tespit edilmiş ve hastalığın 2,3 başlangıcı ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığından şüphe edilir. Kardiyak otoantikorların önemi immunoadsorbsiyon 3-5 ile otoantikorların ortadan kaldırıldıktan sonra DCM hastada hemodinamik iyileşme altı çizilir. Spesifik antijenlerin çeşitli zaten 2,3 tespit edilmiştir ve bu hedeflere karşı antikorlar immunoassay ile tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu ölçümlerin uyarıcı (ve bu nedenle de fonksiyonel olarak etkin) ile bloke edici antikorlar arasında ayırt edemez. Eviden vardır artmaktadırBu ayrım önemlidir 6,7 olduğunu ce. Aynı zamanda, cardiotropic antikorların bir dizi hedeflerin yine tanımlanamayan ve bu nedenle bağışıklık deneyleri ile tespit edilemez olduğu kabul edilebilir. Bu nedenle, kendi antijeninin bağımsız işlevsel olarak aktif cardiotropic antikor tespiti için bir metod kurulmamıştır. Yöntem için arka plan genellikle memeli 8,9 arasında kardiyak proteinlerin işlevsel bölgeleri için gözlenen yüksek bir homoloji olduğu. Bu insan antijenlerine karşı, kardiyak antikorlar erişkin sıçan kardiyomiyositler üzerine DCM hastaların IgG test veriyor insan olmayan hedef hücreleri, ile çapraz reaksiyona girer göstermektedir. Önerilen yöntem, 3 adımlardan oluşur: ilk olarak, IgG immunoadsorbsiyon sütunlar (PlasmaSelect, Teterow, Almanya) dan elde edilen Sepharose birleştirilmiş anti-IgG antikorları kullanılarak hasta plazmadan izole edilir. İkinci olarak, erişkin kardiyomiyositlerde ap kullanılarak bir Langendorff perfüzyon cihaz içinde kolajenaz perfüzyon yoluyla izole edilirotokol önceki eserlerinden 10,11 güncellenmiştir. Elde edilen kardiyomiyositlerde laminin kaplanmış odacıklı coverglasses eklenmiş ve Fura-2, kolaylıkla (Ca 2 +) içindekiler 12 hücre içi kalsiyum gözlemlemek için hücre içine getirilebilir bir kalsiyum-seçici floresan boya ile boyanır. Son aşamada, hücre katı ve Ca 2 hasta IgG etki + alan uyarılan kardiyomiyositlerde geçici bir standart ters floresan bağlı olan bir ticari miyosit kalsiyum ve kasılmasını kontrol sisteminin (IonOptix, Milton, MA, ABD) kullanılarak online olarak izlenir mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan yöntem belirsiz kökenli DCM hastalarda fonksiyonel olarak etkili kardiyak otoantikor saptamak için uygun bir yol sunar. Diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, cAMP seviyelerini 6 üzerindeki etkileri ile β1-adrenoseptör karşı işlevsel aktif antikorların saptanması, örneğin, bizim yöntem, belirli bir epitopa bağımsızdır. Tabii ki literatürde açıklanan diğer epitop bağımsız analizi yani yama klemp tekniği veya izole Purkinje lifleri 14 k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kardiyovasküler Hastalıklarda Humoral Bağışıklık Yanıtları (- Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ve Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2), Ekonomi ve Teknoloji proje ZIM-KF 2727801MD0 Federal Bakanlığı ve İnovasyon Yetkinlik Merkezi tarafından desteklenen ZIK-Yürüyüş, Eğitim ve Araştırma, Almanya Federal Bakanlığı BMBF FKZ 03Z2CN12). Hayvanlarla Konut ve deneyler Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği (FELASA) Laboratuvarı Zootekni (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) ve Federasyon için Derneği'nin önerilerine göre yapıldı.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. . Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
