قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة
Summary
طريقة عرض يوفر وسيلة للكشف عن الأجسام المضادة وظيفية فعالة cardiotropic في البلازما من المرضى الذين يعانون من تمدد عضلة القلب، بغض النظر عن مستضد محددة، من خلال تحليل أثر المناعي المريض معزولة على تقصير الخلوية والعابرين الكالسيوم داخل الخلايا في الفئران المعزولة cardiomyocytes.
Abstract
تمدد عضلة القلب (DCM) هي واحدة من الأسباب الرئيسية لفشل القلب في البالغين الأصغر سنا 1. على الرغم من أن المعروف التصرف الوراثية والتعرض للمواد السامة الأسباب لهذا المرض في حوالي ثلث المرضى، وأصل DCM زال من غير الواضح إلى حد كبير. في عدد كبير من هؤلاء المرضى، فقد تم الكشف عن الأجسام المضادة ضد الحواتم القلب والتي يشتبه في أنها تلعب دورا محوريا في بداية وتطور المرض 2،3. وشدد على أهمية الأجسام المضادة التي كتبها القلب تحسن الدورة الدموية لوحظ في المرضى DCM بعد القضاء على الأجسام المضادة من امتزاز مناعي 3-5. مجموعة متنوعة من مستضدات محددة قد حددت بالفعل 2،3 ويمكن الكشف عن الأجسام المضادة ضد هذه الأهداف بحلول المناعية. ومع ذلك، يمكن لهذه المقايسات لا تميز بين تحفيز (وبالتالي فعالة وظيفيا) ومنع الأجسام المضادة. هناك زيادة evidenم أن هذا التمييز هو 6،7 حاسمة. ويمكن أيضا أن يفترض أن الأهداف لعدد من الأجسام المضادة لا تزال مجهولة cardiotropic وبالتالي لا يمكن الكشف عنها بواسطة المناعية. ولذلك، أنشأنا وسيلة للكشف عن الأجسام المضادة وظيفيا cardiotropic نشطة، مستقلة عن مستضد كل منهما. الخلفية للأسلوب هو التماثل عالية وعادة ما يلاحظ بالنسبة للمناطق الوظيفية للبروتينات القلب في الثدييات بين 8،9. هذا يشير إلى أن الأجسام المضادة الموجهة ضد مستضدات القلب الإنسان ومع الخلايا المستهدفة غير البشرية، والذي يسمح اختبار مفتش الحكومة من المرضى DCM على cardiomyocytes الفئران الكبار عبور الرد. طريقتنا تتكون من 3 خطوات: أولا، يتم عزل مفتش من البلازما المريض باستخدام sepharose و يقترن المضادة للمفتش الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من أعمدة امتزاز مناعي (PlasmaSelect، Teterow، ألمانيا). يتم عزل الثاني، cardiomyocytes الكبار بحلول نضح كولاجيناز في جهاز نضح Langendorff باستخدام AProtocol تعديل من الأعمال السابقة 10،11. وترد في الحصول على cardiomyocytes coverglasses حجرات laminin المغلفة وملطخة FURA-2، صبغة الفلورسنت الكالسيوم الانتقائية التي لا يمكن أن تتحقق بسهولة في الخلية داخل الخلايا لمراقبة الكالسيوم (كا 2 +) محتويات 12. في الخطوة الأخيرة، وأثر مفتش المريض على تقصير الخلايا والكالسيوم 2 + يتم رصد العابرين من cardiomyocytes مجال حفز على الانترنت باستخدام خلية عضلية والكالسيوم التجارية انقباض نظام الرصد (IonOptix، ميلتون، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) متصلة الفلورسنت القياسية لمعكوس المجهر.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة عرض يوفر وسيلة مناسبة للكشف عن الأجسام المضادة وظيفيا فعالة القلب في المرضى الذين يعانون من أصل DCM غير واضحة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى، مثل الكشف عن الأجسام المضادة النشطة وظيفية ضد المستقبلات-β1 من تأثيرها على مستويات المعسكر 6، لدينا طريقة مستق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19، C2) من جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، والوزارة الاتحادية للاقتصاد والتكنولوجيا مشروع 2727801MD0 ZIM-KF ومركز الابتكار الكفاءة – الاستجابات المناعية الخلطية في مجال أمراض القلب والأوعية الدموية ( ZIK-رفع أسعار الفائدة، BMBF FKZ 03Z2CN12) من الوزارة الاتحادية للتعليم والبحث العلمي في ألمانيا. وأجريت التجارب الإسكان ومع الحيوانات وفقا لتوصيات جمعية مختبر علم الحيوان (GESELLSCHAFT FÜR Versuchstierkunde، GV-SOLAS) والاتحاد الأوروبي للمختبر جمعية علم الحيوان (FELASA).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. . Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
