Summary

Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

Published: November 07, 2012
doi:

Summary

Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) is een in vitro assay voor de studie van prion conversie en spanning en species barrières. Het kan ook worden gebruikt als een prion detectie assay.

Abstract

Prionen zijn infectieuze agentia die de onvermijdelijk fatale overdraagbare spongiforme encefalopathie (TSE) veroorzaken bij dieren en mensen 9,18. De prion eiwit heeft twee verschillende isovormen, niet-infectieuze gastheer gecodeerd eiwit (PrP C) en infectieus eiwit (PrP Sc), een abnormaal gevouwen isovorm van PrP C 8.

Een van de uitdagingen van het werken met prion middelen is de lange incubatietijd voorafgaand aan de ontwikkeling van klinische tekenen die volgden gastheer inoculatie 13. Dit traditioneel opdracht lange en dure dieren bioassay studies. Verder zijn de biochemische en biofysische eigenschappen van PrP Sc slecht vanwege hun bijzondere conformatie en aggregatietoestanden gekarakteriseerd.

PrP Sc kan zaad de omzetting van PrP C PrP Sc in vitro 14. PMCA een in vitro techniek die wordt Advantage van dit vermogen gebruik sonificatie en incubatie cycli om grote hoeveelheden PrP Sc produceren hogere snelheid, een systeem met overmaat PrP C en kleine hoeveelheden van het PrP Sc seed 19. Deze techniek heeft bewezen effectief te recapituleren de soort en stam specificiteit van PrP Sc omzetting van PrP C tot prionstam interferentie emuleren, en zeer lage niveaus van PrP Sc amplificeren van geïnfecteerde weefsels, vloeistoffen en milieumonsters 6,7,16, 23.

Dit document beschrijft de PMCA protocol, met inbegrip van aanbevelingen voor het minimaliseren van verontreiniging, het genereren van consistente resultaten, en kwantificeren van die resultaten. We bespreken ook verschillende PMCA toepassingen, inclusief productie en karakterisering van besmettelijke prion stammen prionstam interferentie en de detectie van prionen in het milieu.

Protocol

1. Voorbereiden van de Apparatuur Gebruik Misonix 3000 of 4000 Misonix sonicator (Farmingdale, NY) verbonden met een Thermo Electron Neslab EX-7 waterbad (Newington, NH) om een ​​constante temperatuur te houden van 37 ° C. Sonificeer de monsters in 200 ul dunwandige buis PCR strips met gewelfd deksel verkregen Thermo Scientific (Waltham, MA). Een gloednieuwe sonicator vereist een "break-in"-periode van continue werking 9. Een twee maanden break-in periode bestaat uit een 40…

Representative Results

Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) wordt gebruikt om PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24 amplificeren. Een succesvolle PrP Sc amplificatie wordt aangetoond door een verhoging in bandintensiteit op Western blots van de PK-resistente prioneiwit (migreren tussen 19 en 30 kDa voor hamster prion afgeleide stammen) zoals getoond in figuur 3. De toename van de band intensiteit na PMCA geeft amplificatie van het PK-resistente PrP Sc materiaal. Suc…

Discussion

Uitdagingen van het amplificeren besmettelijke prion-eiwitten zijn de lange incubatietijd en de kosten van de in vivo experimenten. De PMCA techniek is een kosteneffectieve manier om besmettelijke prionen agenten te versterken. Verschillende laboratoria hebben het vermogen van PMCA nauwkeurig prion stammen amplificeren in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.

Prionziekten worden overgedragen tussen soorten. Bessen en Marsh effectief hebben geënt hamsters met overdraagbare …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag Dr Vesper Fe Marie Ramos bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 en G20RR024001) en het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (2R01 NS052609).

Materials

Reagent / Equipment Manufacturer Cat. Number
Misonix 3000 Misonix S-3000
Misonix 4000 Misonix S-4000
Tenbroeck Tissue Grinder Kontes 885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath Thermo Electron Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips Thermo Scientific AB-0451
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor Roche 11 697 498 001
EDTA J.T. Baker 4040-00
DPBS Mallinckrodt Baker Mediatech 21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers Fisher Scientific 14 206 28
Repti Therm Heater Zoo Med Laboratories, Inc. RH-4

References

  1. Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
  2. Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
  3. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
  4. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
  5. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
  6. Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
  7. Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
  8. Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
  9. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
  10. Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
  11. Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
  12. Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
  13. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
  14. Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
  15. Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
  16. Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
  17. Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
  18. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
  19. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
  20. Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
  21. Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
  22. Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
  23. Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
  24. Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
  25. Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).

Play Video

Cite This Article
Saunders, S. E., Bartz, J. C., Shikiya, R. A. Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions. J. Vis. Exp. (69), e4075, doi:10.3791/4075 (2012).

View Video