Summary

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Published: August 08, 2012
doi:

Summary

توضح هذه المقالة لأول مرة إجراء لعزل الخلايا البطانية الإنسان من عروق السري ثم يوضح كيفية استخدام هذه الخلايا لدراسة هجرة العدلات في ظل ظروف التدفق. باستخدام غرفة تدفق كميات قليلة مصنوعة من البوليمر مع الخصائص البصرية للزجاج، ويعيش خلية التصوير فلوري للسكان الخلية نادر ممكن أيضا.

Abstract

العدلات هي النوع الأكثر وفرة من خلايا الدم البيضاء. وهم يشكلون جزءا أساسيا من نظام المناعة الفطرية 1. أثناء التهاب حاد، العدلات هي خلايا التهابية 1 إلى الهجرة إلى موقع الإصابة. تجنيد العدلات إلى موقع الإصابة عملية متدرجة تشمل الأولى، تمدد الأوعية الدموية لزيادة تدفق الدم، وثانيا، تغييرات هيكلية الاوعية الدموية الدقيقة والهروب من بروتينات البلازما من الدم؛، المتداول 3 التصاق، والتهجير من العدلات في جميع أنحاء البطانة، ورابعا تراكم من العدلات في موقع الإصابة 2،3. وقد تطورت وهناك مجموعة واسعة من في والمجراة في المختبر طرق لتمكين دراسة هذه العمليات 4. هذه الطريقة تركز على هجرة العدلات عبر الخلايا البطانية الإنسان.

أسلوب واحد شعبية لدراسة العمليات الجزيئية تشارك في التهجير العدلة يستخدم ن الإنسانeutrophils التفاعل مع الخلايا البشرية الأساسية بطانة الوريد السري (HUVEC) 5. وقد وصفت العدلة العزلة بصريا في مكان آخر وبالتالي هذه المادة سوف تظهر طريقة لعزل HUVEC. عزل مرة واحدة ونمت لالتقاء، يتم تنشيط الخلايا البطانية مما أدى إلى upregulation من جزيئات الالتصاق والتنشيط. على سبيل المثال، تنشيط الخلايا البطانية مع السيتوكينات مثل TNF-α النتائج في زيادة selectin-E و IL-8 التعبير 7. E-selectin يتوسط التقاط والمتداول من العدلات و IL-8 تفعيل يتوسط والتصاق شركة من العدلات. بعد العدلات التصاق transmigrate. يمكن أن يحدث التهجير paracellularly (من خلال تقاطعات الخلية البطانية) أو transcellularly (من خلال الخلية البطانية نفسها). في معظم الحالات، وهذه التفاعلات تحدث في ظل الظروف الموجودة في تدفق 7،8 الأوعية الدموية.

تدفق مواز لوحة الغرفة هو نظام يستخدم على نطاق واسع أن ميلميكروفونات الضغوط العثور على القص الهيدروديناميكية في الجسم الحي، وتمكن هذه الدراسة من تجنيد العدلات تحت حالة تدفق 9،10 في المختبر. العديد من الشركات تنتج مواز غرف تدفق لوحة ولكل منها مزاياه وعيوبه. اذا كانت هناك حاجة فلوري والتصوير، والزجاج أو البوليمر مماثلة بصريا يحتاج إلى استخدامها. الخلايا البطانية لا تنمو بصورة جيدة على الزجاج.

هنا نقدم وسيلة سهلة وسريعة لتصوير التخلص النقيض من ذلك، ومدينة دبي للإنترنت فلوري من هجرة العدلات منخفض باستخدام قناة ibidi حجم الشريحة مصنوعة من البوليمر الذي يدعم التصاق السريع ونمو الخلايا البطانية الإنسان والصفات البصرية التي يمكن مقارنتها مع الزجاج. في هذه الطريقة، ونمت الخلايا البطانية وحفزت في μslide ibidi. وأدخلت في ظل ظروف تدفق العدلات وجرى تقييم التهجير. تمكين التصوير فلوري من تقاطعات في الوقت الحقيقي وتحديد مدى paracellular مقابلالعابر للهجرة.

Protocol

1. العزلة وصيانة خلايا الإنسان بطانة الأوعية الدموية يجب أن تستخدم المستوى 2 إجراءات السلامة البيولوجية عند العمل مع الدم والأنسجة البشرية. قطع مقص باستخدام حبل من المشيمة ومن ثم النظر عن كثب في الحبل السري لتجلط الدم …

Discussion

وقد استخدم الباحثون بصورة روتينية الخلايا البطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة لدراسة تجنيد العدلات والتهجير. ومن الأمثلة على ذلك، ولكنها لا تقتصر على، وخلايا الجلد بطانة الاوعية الدموية الدقيقة 12، الكبد الخلايا البطانية الجيبية 13 و الخلايا ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور بينا Colarusso والتصوير الخلية الحية مرفق على المساعدة التي قدموها مع التصوير وتحليل الصور، والسيدة Lailey للحصول على المساعدة الفنية لها، وحدة 51 في مستشفى التلال في كالغاري، أب لتوفير الحبل السري البشري. الدكتور د. باتل هو يبتدع ألبرتا: الصحة حلول عالم. وأيد هذا العمل من قبل منحة التشغيل من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمنح والمعدات والبنية التحتية من المؤسسة الكندية للإبداع والعلوم ألبرتا والسلطة البحوث.

Materials

Reagent and Equipment Company Catalogue number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197  
Cord buffer     Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM)     M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035  
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016  
Ibidi chambers Ibidi 80606  
TNF-α Prepro Tech 300-01A  
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050  
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X  
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X  

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  2. Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
  3. Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  4. Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
  5. Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
  6. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  7. Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
  8. Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
  9. Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
  10. Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
  11. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  12. Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
  13. Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
  14. Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
  15. Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).

Play Video

Cite This Article
Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

View Video