PCR技术已经成为了许多分子生物学实验室常用技术。这里提供几个常规PCR协议是一个快速指导。因为每一个反应是一个独特的试验,以产生不同产品所需的最佳条件。了解反应中的变量,将大大提高故障排除效率,从而增加了机会,以获得所需的结果。
在生物科学,有技术进步的纪律弹射到发现的黄金年龄。例如,微生物学领域的转化与安东·范·列文虎克的显微镜,它允许科学家们想象的首次原核生物的到来。聚合酶链反应(PCR)的发展是一个创新,改变其影响跨越无数的分支学科,在生物分子科学当然。理论的过程概述了由Keppe和同事在1971年,然而,它是14年,直到完整的PCR过程描述和实验由Kary穆利斯应用,而在鲸鱼座公司于1985年。自动化和完善这一技术进步与引进菌嗜水生 ,因此得名Taq DNA聚合酶的热稳定的DNA聚合酶。
PCR是1鲍威RFUL扩增技术,可以产生一个特定的DNA(即扩增)段供应充足,只有少量的起始原料(即模板DNA或靶序列)。虽然简单,一般无故障,也有复杂的化学反应产生的杂散结果的陷阱。 PCR扩增失败时,它可以导致许多大小不等的非特异性的DNA琼脂糖凝胶带梯子或涂片中出现的产品。有时,没有产品形成所有。另一个潜在的问题发生突变时无意中引入的扩增,在PCR产物的异构人口。 PCR扩增失败可以成为令人沮丧的,除非耐心和细心的故障排除理清和解决的问题(S)。该协议概述了PCR技术的基本原则,提供了一种方法,这将导致大多数靶序列的扩增,并提出了优化反应的战略。按照这样的PCR指南,STudents应该能够:
PCR技术已成为不可或缺的工具,在生物科学宝库。 PCR技术已经改变了科学课程,让生物学家产生了基因组的力量,并具有新功能的混合基因,使具体和准确的临床试验,获得进入基因组和多样性,以及简单的克隆基因作进一步的生化分析的见解。 PCR的应用是有限的,只有挥动其权力的科学家的想象力。有许多书籍和文章描述的PCR新的专门用途,并有更多的将通过开发下一代生物科学。然而,无论预期的方法,基本框架已经保持不变。聚合酶链反应,在其所有的宏伟,是在体外生成一个特定的DNA片段的大量的应用。
设计PCR实验要求的思想和耐心。在图3所示的结果,体现的主要通道之一allenges设计时的PCR优化策略。也就是说,PCR扩增作为一个参数被改变,它可能会影响另一个。作为一个例子,如果初始PCR分最佳退火温度(58℃)进行了一个最佳的Mg 2 +浓度为2.0毫米,那么其结果将产生在图3c看到涂抹。试图解决涂片可能涉及设立含有2.0毫米MgCl 2的反应PCR条件和退火温度调整到61°C。然而,在图3a可见,这不会产生任何产品。因此,它是最好的试剂,滴定,而不是加入一个集中到一个单一的反应,故障排除时,杂散结果。此外,最常见的是调整优化PCR实验的要求是改变Mg 2 +浓度和纠正的退火温度。但是,如果这些变化不减少或废除异常的结果,additi滴定VES和/或改变循环条件如表2-6中所述的协议可能会缓解这一问题。如果一切都失败了,重新设计的引物和尝试,再试一次。
The authors have nothing to disclose.
特别感谢在加州大学洛杉矶分校的克里斯Reddi设立试剂和浇注凝胶和艾琳·桑德斯在加州大学洛杉矶分校的灵感,指导和支持,并校对稿件。我还想感谢吉安卡洛Costaguta和格雷戈里·S·佩恩提供酵母基因组DNA和引物放大GAL3的基因。我还想感谢Bhairav沙阿拍照的实验室设备和试剂用于使数字2 – 4。霍华德休斯医学研究所(HHMI的批准号:52006944),为这个项目提供了资金。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Taq Polymeras | Sigma | D4545-25UN | |
dNTPs | Qiagen | 201225 | |
0.2 ml Thin Wall Tubes PCR tubes | Bio Rad | 223-9469 | |
0.2 ml Thin Wall Tube caps | Bio Rad | 223-9472 | |
TE Buffer: | |||
EDTA disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | |
Trizma-HCl | Sigma | T-3253 | |
Custom Phage Primer | Invitrogen | 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG | |
Custom Phage Primer | Invitrogen | 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT | |
Custom Yeast Primer | Integrated DNA Technologies | SacI-Gal3(-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG | |
Custom Yeast Primer | Integrated DNA Technologies | Gal3(1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG | |
Thermal Cycler | Bio Rad | 170-9703 | My Cycler |
Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | |
Gel electrophoresis | Hoeffer Scientific Instruments | Model HE33 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
Bio Rad Power Pack | Bio Rad | 164-5050 | PowerPac Basic |
Gel Doc system | Fotodyne Incorporated | FOTO/Analyst Investigator FX Workstation |