وقد برزت PCR وتقنية شائعة في العديد من المختبرات البيولوجيا الجزيئية. المقدمة هنا هو دليل سريع لعدة بروتوكولات PCR التقليدية. لأن كل رد فعل هو تجربة فريدة من نوعها، والظروف المثلى المطلوبة لتوليد منتج تختلف. وفهم المتغيرات في رد فعل يعزز إلى حد كبير كفاءة استكشاف الأخطاء وإصلاحها، وبالتالي زيادة فرصة للحصول على النتيجة المرجوة.
في مجال العلوم البيولوجية كانت هناك التقدم التكنولوجي الذي تحظى من خلالها الانضباط في العصور الذهبية للاكتشاف. على سبيل المثال، تحولت مجال علم الأحياء المجهرية مع ظهور المجهر انطون فان يوينهويك، والتي سمحت للعلماء تصور بدائيات النوى للمرة الأولى. تطوير تفاعل البلمرة سلسلة (PCR) هي واحدة من تلك الابتكارات التي غيرت مجرى العلوم الجزيئية مع تأثيره يمتد subdisciplines لا تعد ولا تحصى في علم الأحياء. وقد ورد في النظرية من عملية Keppe وزملاء العمل في عام 1971، إلا أنها كانت آخر 14 عاما حتى إجراء PCR كاملة وصفت وتطبيقها تجريبيا من قبل كاري موليس مؤسسة قيطس بينما في عام 1985. تقدم الأتمتة وصقل هذه التقنية مع الأخذ البلمرة DNA مستقرة من البكتيريا الحرارية aquaticus المستحرات، بالتالي DNA بوليميراز طق الاسم.
PCR هو باورrful تقنية التضخيم التي يمكن أن تولد مخزون وفير من شريحة محددة من الحمض النووي (اي ان يكون AMPLICON) من كمية صغيرة فقط من المواد ابتداء (أي قالب أو تسلسل DNA الهدف). في حين واضحة وعموما خالية من المتاعب، وهناك مطبات التي تعقد رد الفعل تحقيق نتائج زائفة. عندما فشل PCR يمكن أن يؤدي إلى العديد من المنتجات DNA غير محددة ذات أحجام مختلفة التي تظهر سلم أو تشويه من العصابات على المواد الهلامية الاغاروز. في بعض الأحيان لا توجد منتجات تشكل على الإطلاق. وهناك مشكلة أخرى محتملة يحدث عندما يتم تقديمها عن غير قصد الطفرات في amplicons، مما أدى إلى السكان غير متجانسة من المنتجات PCR. يمكن فشل PCR تصبح محبطة ما لم يتم توظيف الصبر واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لفرز دقيق وحل المشكلة (ق). هذا البروتوكول يحدد المبادئ الأساسية للPCR، ويقدم منهجية من شأنها أن تؤدي إلى التضخيم من متواليات الأكثر المستهدفة، ويقدم استراتيجيات لتحسين رد فعل. باتباع هذا دليل PCR، وسانتيجب أن تكون قادرة على udents:
أصبح أداة لا غنى عنها PCR في ترسانة العلوم البيولوجية. غيرت مجرى PCR العلوم السماح علماء الأحياء لانتاج الطاقة على الجينوم، وجعل الجينات المختلطة مع وظائف جديدة، مما يتيح إجراء تجارب سريرية محددة ودقيقة، والحصول على نظرة ثاقبة الجينوم والتنوع، فضلا عن جينات الاستنساخ ببساطة لتحليل كيميائي حيوي آخر. ويقتصر تطبيق PCR فقط من الخيال للعالم أن يتمتع قوتها. هناك العديد من الكتب والأوراق التي تصف استخدامات متخصصة جديدة من PCR، وسيتم تطوير غيرها الكثير في الجيل القادم من العلوم البيولوجية. ومع ذلك، بغض النظر عن النهج المتوقع، فقد ظل الإطار الأساسي نفسه. PCR، في عظمته كل شيء، هو تطبيق في المختبر لتوليد كميات كبيرة من شريحة محددة من الحمض النووي.
تصميم تجربة PCR يتطلب تفكيرا والصبر. النتائج مبين في الشكل 3 مثالا واحدا من الفصل الرئيسيةallenges عند تصميم استراتيجية التحسين لPCR. وهذا هو، كما يتم تغيير معلمة واحدة من PCR، فإنه قد يؤثر آخر. وعلى سبيل المثال، إذا تم تنفيذ PCR الأولي بها في درجة حرارة دون المستوى الأمثل الصلب (58 ° C) مع المغنيسيوم 2 + الأمثل تركيز ملي 2.0، ثم ستكون النتيجة إنتاج مسحة كما رأينا في الشكل 3C. قد محاولة لتشويه تنطوي حل إقامة ظروف PCR مع ردود الفعل التي تحتوي على 2،0 ملم MgCl 2 وضبط درجة حرارة الصلب إلى 61 ° C. ومع ذلك، كما رأينا في الشكل 3A، فإن هذا لن تسفر عن أي منتج. وبالتالي، فإنه من المستحسن أن عاير الكواشف، بدلا من إضافة أحد تركيز على رد فعل واحد، عندما مخرج نتائج زائفة. أيضا، التعديلات الأكثر شيوعا التي مطلوبة من أجل تحسين تجربة PCR هي لتغيير تركيز المغنيسيوم + 2 لتصحيح ودرجات الحرارة الصلب. ومع ذلك، إذا كانت هذه التغييرات لا تلغي أو تقلل نتائج شاذة، المعايرة من additiقد فيس و / أو تغيير بروتوكولات حالة ركوب الدراجات كما هو موضح في الجداول 2-6 التخفيف من المشكلة. إذا فشل كل شيء آخر، إعادة تصميم الاشعال وحاول، حاول مرة أخرى.
The authors have nothing to disclose.
شكر خاص لكريس Reddi في جامعة كاليفورنيا لإقامة الكواشف والمواد الهلامية وتتدفق إلى ايرين ساندرز في جامعة كاليفورنيا للإلهام والتوجيه، والدعم، وتصحيح التجارب المطبعية المخطوطة. وأود أيضا أن جيانكارلو بفضل Costaguta وغريغوري S. باين لتوريد الحمض النووي الجيني الخميرة والاشعال لتضخيم الجين GAL3. وأود أيضا أن أشكر Bhairav شاه لالتقاط الصور من المعدات المخبرية والكواشف المستخدمة لجعل الشكلين 2 – 4. وقدمت التمويل لهذا المشروع من قبل HHMI (HHMI منحة رقم 52006944).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Taq Polymeras | Sigma | D4545-25UN | |
dNTPs | Qiagen | 201225 | |
0.2 ml Thin Wall Tubes PCR tubes | Bio Rad | 223-9469 | |
0.2 ml Thin Wall Tube caps | Bio Rad | 223-9472 | |
TE Buffer: | |||
EDTA disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | |
Trizma-HCl | Sigma | T-3253 | |
Custom Phage Primer | Invitrogen | 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG | |
Custom Phage Primer | Invitrogen | 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT | |
Custom Yeast Primer | Integrated DNA Technologies | SacI-Gal3(-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG | |
Custom Yeast Primer | Integrated DNA Technologies | Gal3(1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG | |
Thermal Cycler | Bio Rad | 170-9703 | My Cycler |
Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | |
Gel electrophoresis | Hoeffer Scientific Instruments | Model HE33 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
Bio Rad Power Pack | Bio Rad | 164-5050 | PowerPac Basic |
Gel Doc system | Fotodyne Incorporated | FOTO/Analyst Investigator FX Workstation |