Summary

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Published: May 14, 2012
doi:

Summary

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da göstermektedir<em> In vitro</em> Veya<em> In vivo</em> Indüksiyon sistemi, iPS hücreleri konvansiyonel ve antijen spesifik hem T lenfositlerin içine ayırt edebiliyoruz.

Abstract

Antijen-spesifik CD8 + sitotoksik T lenfositler (CTL) ve evlatlık hücre transferi (ACT) maligniteleri 1 çeşitliliği için umut verici bir tedavi yöntemidir. CTL'leri Malign hücreleri öldürmek için T hücre reseptörleri (TCR) ve serbest sitotoksin gibi sitokinler ile tümör antijenleri etkileşim suretiyle habis hücrelerin tanıyabilirsiniz. Bu CTL'leri yüksek proliferatif potansiyeli var çünkü, az diferansiye ve merkezi-bellek gibi (yüksek derecede reaktif adlandırılır) CTL'leri ACT tabanlı immünoterapi için optimal nüfus olduğu bilinmektedir, daha farklılaşmış hücreler daha apoptoz daha az yatkındır ve sahip bir homeostatik sitokin 2-7 yanıt yüksek yeteneği. Ancak, hastaların bu tür CTL'leri yüksek bir sayı elde zorluklar nedeniyle, başarılı ACT-temelli tedaviler için son derece reaktif Ag spesifik CTL oluşturmak için yeni bir yaklaşım bulmak için acil bir ihtiyaç vardır.

Kendini yenilenebilir kök TCR transdüksiyonimmün sulandırma için hücre hastalıkların 8-10 tedavisi için terapötik bir potansiyele sahiptir. Ancak, hastaların embriyonik kök hücreler (EKH) elde etmek için bir yaklaşım mümkün değildir. Tedavi amaçlı hematopoetik kök hücrelerin kullanımı (HKH'lerin) yaygın klinik 11-13 uygulanmış olmasına rağmen, HKH'lerin farklılaşma ve proliferatif kapasiteleri azalmış ve HKH'lerin in vitro hücre kültürleri 14-16 in genişletmek için zordur. Son iPS hücre teknolojisi ve gen aktarımı için in vitro bir sistem içinde bir gelişme, herhangi bir cerrahi yaklaşım olmadan hastaların iPS hücreleri oluşturma yeteneğine sahiptirler. Buna ek olarak, EKH gibi iPS hücreleri, in vitro olarak belirsiz proliferatif kapasitesine sahip olması, ve hematopoietik hücrelerin farklılaşması için gösterilmiştir. Böylece, iPS hücreleri EKH veya HKH'lerin ile karşılaştırıldığında ACT-tabanlı immünoterapi kullanılmak üzere, daha büyük bir potansiyele sahiptir.

Burada, T lenfosit üretimi için yöntemler mevcutin vitro iPS hücrelerden cytes, kanser ve immün gözetim teşvik etmek için iPS hücreleri antijen-spesifik CTL in vivo programlama. Bir Çentik ligand ile in vitro olarak uyarılması iPS hücrelerden T-hücresi farklılaşması sürücüler ve tümör büyümesini engelleyen in vivo antijen-spesifik T hücrelerinin içine ayırt iPS hücreleri içinde TCR gen transdüksiyonu ile sonuçlanır. Böylece, iPS hücreleri antijen-spesifik T hücre farklılaşmasını göstermektedir. Çalışmalarımız ACT-temelli tedaviler için antijen spesifik CTL oluşturmak için bir potansiyel olarak daha verimli bir yaklaşım sağlamak ve hastalıklar için tedavi stratejilerinin geliştirilmesini kolaylaştırmak.

Protocol

1. Hücre Kültürü Kültür için (irSNL76 / 7) SNL76 / 7 ışınlanmış besleyici hücrelerin hazırlanması. SNL76 / 7 hücreleri genel olarak% 10 fetal bovin serumu (FBS) Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) ortamında muhafaza edilir. Sıvı azot SNL76 / 7 hücreleri kurtarmadan önce 30 dakika süreyle inkübatör; bir kültür çanak veya cam şişe 37% 0,1 jelatin çözeltisi ° C ile kaplı olacaktır. SNL76 / 7 hücreler konfluense ulaştığında, hücreler tripsinize …

Discussion

ACT-temelli tedaviler için, in vivo tekrar infüzyon için son derece reaktif Ag-spesifik T hücreleri çok sayıda in vitro nesil optimal bir yaklaşımdır. Bizim in vitro yöntem iPS hücreleri iPS hücre türetilmiş hücreler, özellikle dört hafta sonra, dört hafta içinde ölmek çok sayıda fonksiyonel dan T hücrelerinin yol açmaktadır rağmen. Bu çentik dan hayatta kalma sinyallerini DL1 hem de IL-7 ve FLt3L iPS hücrelerden türetilen ata T hücrelerinin hayatta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz sağlamak için Dr Shinya Yamanaka (Kyoto Üniversitesi) teşekkür iPS-MEF-Ng-20D-17 hücre hattı, OT1-2A destekleyen Dr Dario Vignali (St Jude Çocuk Araştırma Hastanesi) • pMig II yapı, Dr Juan Carlos PÇ9-DL1 hücre hattı destekleyen Zuniga-Pflucker (İmmünoloji Bölümü, University of Toronto), ve bu çalışmanın tasarımı yardım için Dr Kent E Vrana (Farmakoloji Anabilim Dalı, Tıp Penn State Üniversitesi). Bu proje Ulusal Kanser Enstitüsü, Barsumian Güven ve Melanom Araştırma Vakfı (J. Şarkısı) adlı Hibe Numarası K18CA151798 ile hibe altında finanse edilmektedir.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD PharMingen 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD PharMingen 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS HyClone SH3007.01
Brefeldin A Sigma B7651
Polybrene Sigma 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza 10-548E
mFlt-3L PeproTech 250-31L
mIL-7 PeproTech 217-17
Gelatin Sigma G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma A7906
Formaldehyde Sigma F8775
0.4 μm filter MIllipore  
Moflo Cell Sorter Dake Cytomation  
Calibur Flow Cytometer BD  
LSR II Flow Cytometer BD  
Mouse restrainer Braintree Scientific  

References

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K., Med, N. .. E. n. g. l. .. J. .. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).

Play Video

Cite This Article
Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

View Video