En électroporation in vitro de la lèvre inférieure rhombique d'embryons de souris Midgestation

La lèvre rhombique est un neuroépithélium embryonnaire situé dans le cerveau postérieur à la jonction entre le tube neural et le roofplate du quatrième ventricule (commentaire dans ^1). La lèvre rhombique peut être subdivisé en la lèvre supérieure rhombiques (URL), qui englobe une rhombomère (r1) et génère neurones du cervelet et la lèvre inférieure rhombiques (Fmin) qui donne lieu à diverses lignées tronc neuronales ^2-4. Dérivés LRL comprennent des neurones auditifs du noyau cochléaire et ceux de l'noyaux précérébelleux qui sont impliqués dans la régulation de l'équilibre et de commande de moteur ^5-8. Neurogenèse de la LRL se produit sur ​​une grande fenêtre temporelle qui englobe jours embryonnaires (E) de 9,5 à 16,5 ^{5, 9.} Différentes lignées neuronales sortir de la LRL que les cellules post-mitotiques (ou qui sont nés) au cours distincts jours de développement au cours de cette fenêtre neurogène.

L'électroporation de constructions d'expression des gènes peut être utilisé pourmanipuler l'expression des gènes dans les progéniteurs LRL et peut potentiellement changer le destin des neurones produits à partir de cette région ^10-12. L'expression des gènes Modification des progéniteurs LRL chez la souris via électroporation in utero a été couronnée de succès pour la manipulation de lignées nés le jour embryonnaire E12.5 ou plus tard, ^{10, 12-14.} Dans électroporations in utero avant E12.5 ont échoué en raison principalement de la létalité associé à la perforation de la roofplate quatrième ventricule, une étape nécessaire dans la prestation de l'ADN exogène qui est électroporation dans le LRL. Cependant, de nombreuses lignées dérivées LRL découlent de la LRL plus tôt que E12.5 ^9. Ces lignées tôt nés comprennent les neurones qui composent le réticulaire latéral, cunéiforme externe, et inférieure noyaux olivaires du système précérébelleux qui fonctionnent pour connecter les entrées de la moelle épinière et du cortex du cervelet ^5. Dans le but de manipuler l'expression dans le LRLd'embryons âgés de moins de E12.5, nous avons développé un système in vitro dans lequel les embryons sont placés dans la culture à la suite d'électroporation.

Cette étude présente une méthode efficace et utile pour manipuler l'expression des gènes des progéniteurs LRL à E11.5. Embryons électroporés avec la protéine fluorescente verte (GFP) entraînée par le promoteur CAG large actif reproductible exprimé la GFP après 24 heures de culture. Un aspect essentiel de cet essai est que l'expression des gènes ne sont modifiées en raison de l'expression du gène exogène et non à cause des effets secondaires qui résultent de l'électroporation et les techniques de culture. Il a été déterminé que les modèles endogènes d'expression des gènes ne sont pas perturbés dans des embryons de électroporées et cultivé. Ce test peut être utilisé pour modifier le destin des cellules issues de la LRL d'embryons âgés de moins de E12.5 grâce à l'introduction de plasmides pour la surexpression ou d'assommer (par ARNi) de différents pro-des facteurs de transcription neuronaux.