ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation
Summary
המחקר מתאר את התפתחות<em> במבחנה</em> Electroporation טכניקה המאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים שפתיים rhombic התחתון של עוברי midgestation.
Abstract
השפה היא rhombic neuroepithelium עובריים למוח האחורי ממוקם בצומת שבין הצינור העצבי ואת roofplate של החדר הרביעי (בדיקה ב 1). השפה rhombic נחלקים השפה rhombic העליון (URL) הכולל rhombomere 1 (R1), ויוצר הנוירונים של המוח הקטן ואת השפתיים rhombic נמוך (LRL), אשר מעלה את מגוון שושלות גזע המוח נוירונים 2-4. נגזרים LRL כוללים הנוירונים קולי של גרעינים שבלול ושל גרעינים precerebellar המעורבים בוויסות איזון ושליטה מוטורית 5-8. Neurogenesis מ LRL מתרחשת מעל חלון הזמני גדול שמקיף ימים עובריים (ה) 9.5-16.5 5, 9. שושלות עצביים שונים לצאת מן LRL כמו תאים postmitotic (או נולדו) במהלך ימים התפתחותיים שונים במהלך חלון זה neurogenic.
Electroporation של מבנים ביטוי גנים יכולה לשמשלתפעל ביטוי גנים אבות LRL ואף עלולים לשנות את גורלם של נוירונים המופקים באזור זה 10-12. ביטוי גנים שינוי של אבות LRL של העכבר באמצעות ב electroporation ברחם היה מוצלח מאוד עבור מניפולציה שושלות שנולדו ביום עובריים E12.5 או במאוחר 10, 12-14. ב electroporations ברחם לפני E12.5 לא הצליחו בעיקר בשל הקטלניות קשור ניקוב roofplate החדר הרביעי, צעד הכרחי באספקת DNA אקסוגני אשר electroporated אל LRL. עם זאת, רבים שושלות הנגזרות LRL נובעים LRL לפני E12.5 9. שושלות אלו שנולדו לפני כן כוללים הנוירונים המרכיבים את הרשתית לרוחב, דמויי יתד? חיצוני, גרעינים olivary הנחות של מערכת precerebellar שבה לתפקד להתחבר כניסות מ חוט השדרה אל קליפת המוח הקטן 5. על מנת לתפעל ביטוי LRLעוברים מתחת לגיל E12.5, פיתחנו במערכת במבחנה שבה עוברים ממוקמים בתרבות בעקבות electroporation.
מחקר זה מציג שיטה יעילה ואפקטיבית על מניפולציה של ביטוי גנים של אבות LRL ב E11.5. עוברים electroporated עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מונע מן האמרגן החטיבה פעילה רחב reproducibly הביע GFP לאחר 24 שעות של תרבות. היבט חשוב של assay זה הוא ביטוי גנים משתנה רק בגלל הביטוי של הגן אקסוגני ולא בגלל השפעות משניות הנובעות electroporation וטכניקות culturing. נקבע כי ביטוי את דפוסי גנים אנדוגניים להישאר ללא הפרעה עוברים electroporated ותרבותיים. Assay זה יכול להיות מנוצל כדי לשנות את גורלו של תאים המתפתחים מתוך LRL של עוברים מתחת לגיל E12.5 באמצעות הקדמה של פלסמידים עבור ביטוי יתר או להפיל (באמצעות RNAi) של אחר בעדגורמי שעתוק עצביים.
Protocol
Discussion
בטכניקה electroporation במבחנה הציג במחקר זה היא מתודולוגיה חדשנית יכול להיות מנוצל ביעילות לתמרן ביטוי גנים העוברים מתחת לגיל 12 ימים של הריון. המיקום של העוברים לתוך תרבות מאפשרת ביטוי של גן הציג עוקף הקטלניות נצפתה כאשר עוברים electroporated מותר להישאר in vivo. טכני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ג'יין ג'ונסון עבור Math1, Ngn1, ואת נוגדנים Ptf1a וקוני Cepko עבור pCAG :: GFP פלסמיד. עבודה זו מומנה על ידי NIH 1R15HD059922 R15-01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. 신경과학. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
