Ретроградная Флуоресцентная маркировка Позволяет Целевые Внеклеточные единичные Запись с Выявленные Нейроны<em> В естественных условиях</em

1. Подготовка краски покрытием иглы Электролитически точить 160 мкм в диаметре вольфрамовой проволоки 15. Final диаметром кончика иглы должна составлять от 5-50 мкм. Количество игл необходимости в зависимости от размеров области клеймо. Мы подготовили 5 игл для 3-5 инъекций в заднюю exterolateral ядра (ELP). В ночь перед экспериментом, поместите каплю (<0,25 мкл) 2 мМ декстран-конъюгированные Alexa Fluor красителя 10000 МВт на дистальной 100 мкм каждой иглы. Разрешить иглы высохнуть на воздухе при комнатной температуре, в результате чего концентрированного красителя на конце. Хранить иглы при 4 ° С в темном контейнере, чтобы защитить их от света. 2. Подготовка животных для хирургии Общей анестезии путем размещения рыбы в раствор 300 мг / л MS-222 в резервуар. Взвесьте длина рыбы и мера вилкой (кончика морды до вилки хвостового плавника) и тела глубиной (максимальная спинно-Вентрал расстояние в поперечной плоскости). Эти измерения должны находиться в пределах диапазонов, указанных в таблице 1, так что рыба помещается внутрь регистрирующей камере, достаточно мал, чтобы разместить под водой погружением объектива микроскопа (Рис. 1). Зафиксировать и электрически отключить рыбы путем инъекции 100 мкл 3 мг / мл flaxedil в дорсальную мускулатуру тела. Заполните записи камеры (рис. 1А) с баком для воды. Поместите рыбу вентральной стороной вниз на платформу в центре камеры (рис. 1). Доставить газированные раствора 100 мг / л MS-222 с помощью пипетки наконечник помещается в рот рыбы (1-2 мл / мин). Стабилизировать рыбу палками зафиксирован в воск размещены на обеих сторонах тела (рис. 1в). Следить за здоровьем рыб, проверяя для непрерывного потока крови в глазных сосудов и нормального цвета тела. Поворот платформы вдоль его длинной оси и опускать заднюю часть платфORM так, чтобы одна сторона спинной поверхности головы рыбы подвергается над водой, а остальные тела рыбы остается погруженным. Небольшой кусочек Kimwipe должен быть сделан на любой не погруженной части кожи, чтобы предотвратить высыхание. 3. Хирургия (рис. 2) Основные хирургические процедуры, описанной здесь хорошо известна и надежно использованы для слепых в естественных условиях в записях mormyrids 16. Для других приложений, подвергать нужный регионов для маркировки и записи. Область, содержащую аксонов в клетках интерес должен быть доступен на покрытых красителем иглы. Область, содержащую более проксимальных сегментах те же аксоны должны иметь достаточное пространство над тканью, чтобы приспособить рабочее расстояние воды погружения линз (2 мм в нашем случае). Применяют 0,4% раствор лидокаина с открытой поверхности головки с помощью ватной палочки. Используя лезвие скальпеля, вырезать по периметру прямоугольного куска кожи. Снимите прямоугольника с помощью пинцета. Размер прямоугольника будет масштабироваться с размером рыбы, но должно быть около 3 мм х 5 мм для рыбы 6,2 см (рис. 2А). Боковые края прямоугольника должны совпадать с центра глаза, передний край прямоугольника должна быть только позади глаз, и медиального края прямоугольника должна быть только боковая срединной рыбы. Развернуть подвергается Череп anteromedially подвергать дополнительным 2,5 мм квадратных непересекающиеся области (рис. 2В). Полностью очистить и высушить открытой поверхности черепа помощью скальпеля, чтобы очистить лишнюю ткань и Kimwipes и принудительной циркуляцией воздуха, чтобы высушить поверхность (рис. 2С). Клей металлический столб, на переднем подвергается черепа регионе с помощью суперклея. Подождите, пока клей полностью не высохнет (Рис. 2d). </li> Удалите прямоугольник черепа, примерно 2 мм х 4 мм для 6,2 см рыбы. Используйте бормашины с ~ 0,5 мм в диаметре шаровой мельнице наконечник из карбида редеть периметру прямоугольника. Затем с помощью скальпеля и пинцета, вырезать по периметру прямоугольника и очистить его, чтобы выставить основной мозг. Дополнительные сверления или резки с небольшой ножницы могут быть необходимы для полного доступа EL (рис. 2Е). Если мышцы кровотечении электрокоагуляции может быть использована установка. Срежьте и твердой мозговой оболочки (цвет) и мягкой мозговой оболочки (прозрачная) с помощью пружинных ножниц или иглы и удалить вырезанные части с парой щипцов. Передняя и задняя части exterolateral ядра (EL) теперь видны, английскому языку и ELP, соответственно (рис. 3А). 4. Ретроградной маркировки аксонов интересов Расположите манипулятор с покрытыми красителем иглой (сделали в шаге 1) выше целевого область, содержащая аксоны Интерест, в нашем случае ELP. Быстро ввести иглу примерно 25 мкм в ткани. Подождите 15-30 секунд, пока все красители не оторвался, а затем втянуть иглу. Повторите с дополнительной свежей иглы по мере необходимости, размещая каждый из них в другую папку, чтобы краситель распределяется по всему целевом регионе. Мы использовали 3-5 игл на подготовку. Промыть избыток красителя из полости с раствором Рингера Хикман автора. Подождите по крайней мере 2 часа для поглощения красителя и транспорта. 5. Визуализация аксонов интересов Поместите записи камеры, наряду с рыбой, под цели вертикально фиксированной этап epifluorescent микроскопа. Как тело рыбы закрывает проникновения света, как белый, так и люминесцентные источники света должны прийти сверху. Тщательного размещения волоконно-оптических источников света над полости черепа позволяет удовлетворительные изображения светлого. Для эпифлуоресцентной осмотр, флуоресцентный фильтрспецификации должны совпадать с поглощением / спектра излучения красителя. Переключатель дыхания в пресной воде резервуара и поддерживать такой же скорости потока. Наведите грозотроса в открытой полости мозга и подключиться к земле Headstage записи (см. 6.3). Поместите пару электродов записи рядом с основания хвоста и подключения к дифференциальному усилителю и записывающего устройства (например, монитора аудио, осциллограф или компьютер) для мониторинга электрического разряда команду органа (EODC). После того, как рыба восстанавливается после анестезии, EODC может быть использована в качестве индикатора состояния рыбы. Подготовка масштабного эскиза области мозга, просматриваемые при малом увеличении. Включите крупных кровеносных сосудов в качестве ориентиров (может варьироваться от рыбы к рыбе), чтобы определить точное местонахождение меченых аксонов видно только при большом увеличении (рис. 3D). Подтвердите красителя размещения. Вид от первого всей ткани светлого освещение для ориентации ( <stronG> рис. 3А). Затем просмотрите с люминесцентным освещением (рис. 3В). ELP будете иметь диффузные маркировки (рис. 3В и 3С). Минимизировать возбуждения флуоресценции ограничить фотодинамической и фототоксические эффекты красителя. Используйте судах в качестве ориентиров, чтобы найти ELa при большом увеличении. Осветить флуоресцентный свет при поиске меченого аксона вблизи поверхности. (Рис. 4). 6. Запись активности внеклеточных Вытяните всасывающий регистрирующих электродов с использованием 1 мм Диаметр, мм 0,58 ID боросиликатного стекла с капиллярной нити. Идеальный размер наконечника будет зависеть от диаметра целевой аксонов, который в нашем случае составляет 0,1-0,2 мкм 17. Для нашего приложения диаметра электрода были 1,5 ± 0,4 мкм (диапазон: 1,0-2,4 мкм) с 5 мм длиной, узкий хвостовик, чтобы приблизиться меченых аксонов без перемещения окружающих тканей плотно упакованы. Заполните электронэлектроды с фильтрованной Рингера Хикман автора. Последнее сопротивление наконечника 45,2 ± 38,0 МОм (диапазон: от 16 до 155 МОм). Поместите электрод в держатель электрода с давлением порта и подключить его к усилителю Headstage установлены на манипуляторе. Выполнить высокого давления от давления порта Т-образном перекрестке, оканчивающиеся на манометр и шприц для мониторинга и контроля давления, соответственно. Соединение Headstage на усилитель и аналого-цифровой синхронизации устройства. С 30 мбар внешнее давление в электродной линии, поместите электрод рядом с меченым аксона. Низкий уровень освещенности камера сопряжена с ПО для обработки изображений используется для визуализации пипетки размещения. Начать вблизи поверхности ткани и продвижение электрода к аксона. По мере приближения к аксона, внешнее давление должно вызывать небольшое, но заметное движение аксона. В то время как электрод находится рядом с аксона (рис. 4, вверху) записать мощнымIAL на электроде во время представления тестовых воздействий (в нашем случае, мы использовали 100 мс монофазную положительных и отрицательных поперечных импульсов при интенсивности 20 мВ / см; рис. 1А). Потенциалы действия не должна наблюдаться, хотя электрический артефакт подтверждает надлежащее записи / стимуляции (рис. 4, внизу). Отпустите внешнее давление в электроде и повторить стимуляцию / записи. Потенциалы действия должны быть по-прежнему не наблюдалось (рис. 4В). Нанесите небольшое (125 ± 25 мбар) на входе, к электроду и повторить стимуляцию / записи. Потенциалы действия должны теперь наблюдается в ответ на стимуляцию (рис. 4в). Спонтанная активность могут также произойти. Если потенциалы действия не наблюдается, разблокирование всасывающего, очистите электрод с небольшим давлением, переместите электрод незначительно, а попытка всасывания снова. Как только потенциалы действия видны, закрыть напорную линию. Стимулирование и записать в качествелучшего. 7. Прекращение и утилизация После того как все необходимые записи полны, переключиться на дыхание с 100 мг / л MS-222 пока EODC не остановится. Нет EODC не должно быть обнаружено по крайней мере 10 минут. Утилизировать рыбы в соответствии с ведомственным руководящим принципам и утвержденных протоколов по уходу за животными. 8. Представитель Результаты Для нашего конкретного применения, мы заинтересованы в изучении стимулом кодирования центральных сенсорных нейронов. Успешное записи из меченых аксонов позволяет производить анализ единичного ответов на сенсорной стимуляции 18. 5А показаны репрезентативные потенциалов действия вызванные поперечной electrosensory стимуляции с использованием биполярных электродов, расположенных на внутренней стороне левой и правой стен записи камеры. Спайк раз может быть представлена ​​в виде графика растровые шип (рис. 5В). 25 мс предварительной записи стимулом ветравл показывает низкий уровень спонтанной активности. Данный Ела "небольшая клетка" длинный-проход настроены на длительности стимула в стимул интенсивностью 6 мВ / см, увеличивая число колосьев на повторения, так как длительности стимула увеличивается (рис. 5в). Среднее первый всплеск задержка 4,28 ± 0,16 мс, в соответствии с ожидаемой задержкой для небольших клетках по английскому языку 11. Рисунок 1. Спецификации для записи камеры, которые могут поместиться под цель фиксированной этапе epiflourescent микроскопом. (A) в масштабе квадратных камеры записи, сделанной с плексигласа показывает сверху, сбоку и сзади. Парный набор стимулирующих электродов (звездочки) на периферии позволяют либо поперечным (красно-черный) или продольных (сине-желтый) стимуляции. Дополнительные кусок оргстекла в углу, с резиновым покрытием отверстием в центре (оранжевый),держит всасывающую пипетки, что поддерживает постоянный уровень воды. Две вертикальные нержавеющей стали сообщений ввинчивается в нижней части камеры (зеленым) подключаются к нержавеющей стали сообщений (зеленый контур), прикрепленной к платформе поддерживать рыб (светло-серый, подробно описаны в C) через регулируемые зажимы диска. Фотографии камеры показан ниже в масштабе чертежа. (Б) индивидуальные и собран вид круговой Пластиковые зажимы дисков, используемых для крепления платформы на вертикальных стойках. Каждый диск зажим имеет паз (зеленый) на должность и центральное отверстие для затяжки винта. Диск зажимы повернуты так канавки расположены перпендикулярно друг к другу. Затяжка винтов (красный) зажимы сообщения на место, чтобы предотвратить дальнейшее вертикальное и вращательное движение платформы. (C) Фронтальные и боковые в масштабе вид на плексиглас платформы используются для хранения рыбы на месте. Платформа покрыта слоем парафина (синий), который содержит деревянных DoweLS (черные полосы) для поддержки рыбы. Шланги для вентиляции легких рыба проходит через отверстие в "изголовье" на платформе и заканчивается в пипетки помещают в рот рыбы. Нержавеющая сталь пост головы (серая полоса) подключается к платформе через шаровой шарнир позволяет вращение 360 градусов. Нержавеющая сталь горизонтальных сообщений (зеленый) ввинчивается в любом конце платформы. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 2. Схематический обзор хирургии глядя на спинной поверхности головы. (А) Сделайте четыре порезы, в указанном порядке, снять прямоугольный кусок кожи (красный). (B) продлить часы anteromedially чтобы удалить дополнительную прямоугольный кусок кожи (зеленый). (C) Соскребите оставшиеся жир или связокперемещении лезвие скальпеля, как указано стрелкой, и высушить поверхность полностью с Kimwipes и нагнетаемого воздуха. (D) Клей нержавеющей стальной столб с черепом использованием супер клей. Шкала бар в относится к AD. (Е) использование бормашины сделать четыре порезы, в указанном порядке, снять прямоугольный кусок кости (синий), выставляя передние и задние exterolateral ядер (ELA и ELP, соответственно) . Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 3. Флуоресцентное мечение в заднем exterolateral ядра 3 часа после инъекции декстран-конъюгированные Alexa Fluor 568. (А) передней и задней exterolateral ядер (ELA и ELP, соответственно) визуализировали с ярким освещением поля сверху. Вниманиечто обширная миелинизации в ELa дает ему относительно яркой внешности, что отличает его от ELP. (B) же районе визуализированы использованием эпифлуоресцентной рассматривается через TRITC фильтр. (C) объединенного изображения с помощью синего (светлое) и красный для B (TRITC). (D) Пример масштабного чертежа из ELP английскому языку и в том числе крупных кровеносных сосудов (красные линии), который можно использовать в качестве ориентиров для определения точного местоположения меченых аксонов видно только при большом увеличении (точное расположение кровеносных сосудов варьируется от рыбы к рыбе). Пунктирная линия указывает границу между английскому языку и ELP. (E) Примеры изображений, приобретенный с помощью фильтра TRITC из 5 различных препаратов иллюстрирующих ряд успешных моделей маркировки небольших клеток и аксонов Somas по английскому языку. Рисунок 4. Единичные внеклеточной записиот меченого аксона. (A) записи электрод (стрелки) при положительном давлении располагаются рядом с меченым небольшой аксон клетки в ELa (вверху) записывает только край артефакт (стрелки) в ответ на 100 мс 20 мВ / см монофазные, контралатеральные-положительных, поперечный импульс квадратные (внизу). (B) Освобождение внешнее давление от электрода (стрелки) вызывает аксона немного двигаться к электроду (верхняя), но до сих пор нет ответа на стимул (внизу). ( С) небольшое отрицательное давление тянет аксона в электрод (сверху, стрелки) и потенциалов действия в ответ начала стимула теперь видны (на дне, звездочка). Нижняя часть всех трех панелей наложением ответов на 20 повторений стимула. Рисунок 5. Типичные результаты помощью этой техники. (A) 5 следов образецпоказывающие действие потенциалов, вызванных 0,1 мс 6 мВ / см монофазные, контралатеральной-положительных, поперечная квадратных стимул импульса. (B) растровой график, показывающий шип раз в течение 20 повторений окна 75 мс для записи той же единицы стимулировали в момент времени 0 с 6 мВ / см стимулов в диапазоне длительностей перечисленные справа. (с) время, настройка кривой количественной ответов изображена в растровом, как пики на стимул повторения. Масса (г) Длина вил (см) Тело Глубина (см) Означать 2,42 6,20 1,14 Стандартное отклонение 0,64 0,52 0,18 Диапазон 1.2-4.0 5.5-8.4 0,9-1,6 Таблица 1. Оптимальныйвеса, длины тела и диапазонов глубины для рыб. оптимальный вес, длина вил (кончика морды до вилки хвостового плавника) и тела глубиной (максимальная спинно-вентральной расстояния в поперечной плоскости) Диапазоны позволяет рыбе, чтобы поместиться в записи камеры показано на Рисунок 1. Рыбы, которые слишком малы, может быть меньше шансов выжить хирургии и будет иметь небольшой ELP, что делает краситель размещения сложным. Рыбы, которые являются слишком большими, будет иметь большой, выходящее за всякие пределы мозжечка, которые позволят сократить доступ к английскому языку и ELP и может предотвратить снижение высокой мощности, водные погружения цели достаточно близко, чтобы сосредоточиться на ELa и ELP. Применение сайта Тип красителя Рыба попыталась Этикетка по английскому языку Этикетка в ELP Единицы пытались Записи EL Alexa Fluor инъекций 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8.0%) ELa Alexa Fluor пропитанной фильтровальной бумаги 1 0 0 0 0 ELa Ди-я в ДМСО 8 6 (75,0%) 0 0 0 ELa Ди-О кристаллы 5 3 (60.0%) 2 (40,0%) 9 0 ELP Твердые кристаллы Alexa Fluor 2 0 2 (100%) 0 0 ELP Alexa Fluor покрытием вольфрамовой проволоки 43 <stronG> 29 (67,4%) 41 (95,3%) 119 26 (21,8%) Таблица 2. Успех ставки для каждого красителя методом инъекции. Показатели эффективности каждого красителя методом инъекции. Методы делятся основана на месте инъекции и тип красителя. Для каждого метода, общее количество рыбы пытались и процент этих экспериментов, что привело к успешному маркировки в ELa и ELP показано. Отметим, что целевой области записи противоположно узла приложения (полужирный коробки). Для инъекции, поглощение красителя было считать успешным с обозначением обоих Somas и аксонов. В противоположность этому, на записи сайта, только препараты с мечеными аксоны считались успешными экспериментами маркировки. Общее число попыток единиц и процент этих блоков, в результате успешной записи также показаны. # Впрыска сиTES Средний объем одной инъекции (мкл) Диапазон объемов на инъекцию (мкл) Средний суммарный объем инъекций (мкл) Диапазон от общего объема инъекции (мкл) Микроинъектор с Хэмилтоном 3 или 4 0,144 0,091 – 0,91 0,516 0,378 – 0,669 Nanoinjector со стеклянной пипетки 2 – 4 0,069 (фиксированный) Фиксированном объеме вводится 1-6 раза 0,621 0,414 – 0,966 Микроинъектор со стеклянной пипетки 2 – 6 0,093 0,058 – 0,202 0,360 0,252 – 0,540 Таблица 3. Количества краситель применяется для каждого из трех методов, используемых для введения Alэкза Fluor в количествах ELa красителя применяется для каждого из трех методов, используемых для введения Alexa Fluor в ELa (первый способ из таблицы 2). Краска инъекции в Эла проводились как nanoinjector и микроинъектор используя либо 33 калибровочных Гамильтон шприц иглой или вытащил стеклянный капилляр пипетки. Мы варьировали количество инъекций, объем на инъекцию, а общий объем красителя инъекции.