Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em> In vivo</em

1. Prepare Needles Dye-revestidos Eletroliticamente aguçar a 160 um de diâmetro 15 fio de tungstênio. Diâmetros finais ponta da agulha deve variar 5-50 um. O número de agulhas necessários depende do tamanho da região a ser rotulada. Preparamos cinco agulhas por 3-5 injeções no núcleo exterolateral posterior (ELP). Na noite anterior à experiência, colocar uma gota (<0,25 ul) de corante de 2 mM de dextrano conjugado com Alexa Fluor 10.000 MW para os distais 100 mm de cada uma das agulhas. Permitir que as agulhas secar ao ar à temperatura ambiente, deixando corante concentrada na ponta. Armazenar as agulhas a 4 ° C num recipiente escuro para proteger da luz. 2. Prepare animal para a cirurgia Induzir a anestesia geral, colocando o peixe em uma solução de 300 mg / L de MS-222 na água do tanque. Pesar o peixe e medir o comprimento do garfo (ponta do focinho até à mesa da nadadeira caudal) e profundidade corporal (máximo dorso-ventral distância no plano transversal). Estas medições deve cair dentro dos intervalos indicados na Tabela 1, de modo que o peixe se encaixa dentro de uma pequena câmara de registo suficiente para colocar sob uma objectiva de microscópio de imersão em água (Figura 1). Imobilizar e silenciar electricamente o peixe por injecção de 100 ul de 3 mg / ml flaxedil na musculatura dorsal do corpo. Encha a câmara de gravação (Figura 1A) com água do tanque. Colocar o peixe ventral-lateral para baixo sobre a plataforma no centro da câmara (Figura 1). Entregar uma solução arejada de 100 mg / L de MS-222 utilizando uma ponta de pipeta, colocado na boca do peixe (1-2 ml / min.) Estabilizar o peixe com hastes fixadas em cera colocados em ambos os lados do corpo (Figura 1C). Monitorar a saúde do peixe, verificando o fluxo de sangue contínuo nos vasos oculares e uma cor de corpo normal. Gire a plataforma ao longo de seu eixo longitudinal e abaixar a extremidade traseira do platforme de modo que um dos lados da superfície dorsal da cabeça do peixe é exposta acima da água, enquanto que o resto do corpo do peixe permanece submerso. Um pequeno pedaço de Kimwipe deve ser colocado em qualquer parte não submersa da pele para evitar a secagem. 3. Cirurgia (Figura 2) O procedimento cirúrgico básico descrito aqui é bem estabelecida e usada de forma confiável para cegos em gravações vivo em Mormyrids 16. Para outras aplicações, expor as regiões desejadas para a rotulagem e gravação. A região que contém os terminais dos axônios das células de interesse deve ser acessível por uma agulha dye-revestido. A região que contém os segmentos mais proximais desses mesmos axónios deve ter espaço suficiente acima do tecido para acomodar a distância de trabalho da lente de imersão em água (2 mm em nosso caso). Aplicar uma solução de 0,4% de lidocaína à superfície exposta da cabeça através de um Q-tip. Usando uma lâmina de bisturi, cortar o perímetro de um pedaço rectangular da pele. Remover o rectângulo usando um par de fórceps. O tamanho do rectângulo será dimensionado com o tamanho do animal, mas deverão ser de aproximadamente 3 mm por 5 mm por 6,2 cm de peixe (Figura 2A). O bordo lateral do rectângulo, deverá alinhar com o centro do olho, a borda anterior do rectângulo deve ser apenas para posterior do olho, e o bordo medial do rectângulo deve ser apenas lateral da linha média do peixe. Expandir a região exposta ântero crânio para expor um adicional de 2,5 mm Área não-sobreposição quadrada (Figura 2B). Completamente limpar e secar a superfície exposta do crânio com a lâmina de bisturi para raspar qualquer excesso de tecido e Kimwipes e ar comprimido para secar a superfície (Figura 2C). Cole um poste de metal para a região crânio exposto ântero-medial usando Super Glue. Espere até que a cola estiver completamente seco (Figura 2D). </li> Remover um rectângulo de crânio, aproximadamente 2 mm x 4 mm para 6,2 cm de peixe. Use uma broca de dentista com a ~ 0,5 milímetros de diâmetro bola moinho ponta de metal duro para diluir o perímetro do retângulo. Em seguida, utilizando um bisturi e pinça, cortar o perímetro do rectângulo e descascar para expor o cérebro subjacente. Perfuração ou corte com uma tesoura pequena adicional pode ser necessário para expor totalmente EL (Figura 2E). Se ocorrer uma hemorragia muscular, pode ser utilizada uma unidade de electrocautério. Cortar tanto a dura-máter (pigmentado) e a pia-máter (clara), utilizando tesouras de mola ou de uma agulha e remover as porções cortadas, com um par de pinças. As porções anterior e posterior do núcleo exterolateral (EL) estão agora disponíveis, ELA e ELP, respectivamente (Figura 3A). 4. Marcação retrógrada de axônios de Interesse Posicione um manipulador com uma agulha dye-revestido (feito na Etapa 1) acima da região de destino que contém axônios dos interest, no nosso caso ELP. Rapidamente inserir a agulha aproximadamente 25 um para o tecido. Aguarde 15-30 segundos, até que todo o corante tem de sair e, em seguida, retirar a agulha. Repita o procedimento com agulhas frescas adicionais, conforme necessário, colocando cada um em um local diferente, de modo que a tinta é distribuída por toda a região de destino. Foram utilizados 3-5 agulhas por preparação. Lavar o excesso de corante da cavidade com solução de Ringer de Hickman. Espere pelo menos 2 horas para a absorção e transporte de corante. 5. Visualização de axônios de Interesse Coloque a câmara de gravação, juntamente com o peixe, abaixo do objectivo de uma posição vertical, microscópio de epifluorescência fases fixa. À medida que o corpo do peixe oclui a penetração da luz, tanto fontes de luz fluorescente branca e deve vir de cima. Uma colocação cuidadosa de uma fonte de luz de fibra óptica acima da cavidade do crânio permite que as imagens de campo claro satisfatórios. Para visualização de epifluorescência, filtro de fluorescênciaespecificações devem corresponder a absorção / emissão do espectro do corante. Alterne a respiração de água do tanque fresco e manter a mesma taxa de fluxo. Coloque um fio terra na cavidade do cérebro exposto e conectar-se ao terreno do headstage gravação (ver 6.3). Coloque um par de eletrodos de registro junto à base da cauda e se conectar a um amplificador diferencial e um dispositivo de gravação (por exemplo, monitor de áudio, osciloscópio, ou computador) para monitorar o comando de descarga do órgão elétrico (EODC). Depois de o peixe se recupera da anestesia, o EODC pode ser usado como um indicador da condição do peixe. Prepare um esboço escala da região do cérebro visto em baixa ampliação. Incluir vasos sanguíneos importantes como marcos (pode variar de peixe para peixe) para identificar a localização exata de axônios marcados visíveis apenas sob alta ampliação (Figura 3D). Confirmar a colocação corante. Primeiro ver o tecido inteiro com brightfield iluminação para orientação ( <strong> Figura 3A). Então veja com iluminação fluorescente (Figura 3B). ELP terá marcação difusa (Figuras 3B e 3C). Minimizar a excitação de fluorescência para limitar os efeitos fotodinâmica e fototoxicidade do corante. Use os vasos como marcos para localizar ELA sob alta ampliação. Iluminar com luz fluorescente, enquanto busca de um axônio marcado perto da superfície. (Figura 4). 6. Registro de atividade extracelular Puxe eletrodos de registro de sucção utilizando 1 mm de diâmetro externo, 0,58 mm de diâmetro capilar de vidro de borosilicato com filamento. Tamanho da ponta ideal dependerá do diâmetro dos axónios alvo, que, no nosso caso, é 0,1-0,2 uM 17. Para a nossa aplicação, diâmetros de ponta do eletrodo foram de 1,5 ± 0,4 mM (intervalo: 1,0-2,4 mm), com a 5 mm de comprimento, haste estreita, a fim de aproximar os axônios rotulados sem mover o tecido circundante densamente. Preencha electrodos filtrada com solução de Ringer de Hickman. Resistência dica final é de 45,2 ± 38,0 mohms (intervalo: 16-155 mohms). Coloque o eletrodo em um porta-eletrodo com uma porta de pressão e conectá-lo a um amplificador headstage montado em um manipulador. Executar uma linha de pressão da porta de pressão para um final entroncamento em um manômetro e uma seringa para monitorar e controlar a pressão, respectivamente. Ligue o headstage a um amplificador e um dispositivo de aquisição de analógico para digital. Com 30 mbar pressão externa na linha do eletrodo, colocar um eletrodo ao lado de um axônio rotulados. Uma câmera de baixo nível de luz com interface com o software de imagem é usado para visualizar a colocação da pipeta. Comece perto da superfície do tecido e promover o eletrodo para o axônio. Ao se aproximar do axônio, a pressão externa deve causar um movimento leve, mas perceptível do axônio. Enquanto o eletrodo fica ao lado do axônio (Figura 4A, em cima) registrar o potenteial no eléctrodo enquanto que a apresentação de estímulos de ensaio (no nosso caso, foi utilizada a 100 mseg monofásicas impulsos transversais positivos e negativos a uma intensidade de 20 mV / cm, a Figura 1A). Os potenciais de ação não deve ser observado, apesar de um artefato elétrico confirma gravação / estimulação adequada (Figura 4A, inferior). Solte a pressão externa no eletrodo e repita estimulação / gravação. Os potenciais de ação não deve ainda ser observado (Figura 4B). Aplique uma leve (125 ± 25 mbar) de sucção para o eletrodo e estimulação / gravação de repetição. Os potenciais de acção deve ser agora observado em resposta à estimulação (Figura 4C). Também podem ocorrer actividade espontânea. Se os potenciais de ação não são observadas, solte a sucção, limpe o eletrodo com uma ligeira pressão, coloque o eletrodo um pouco, e tentativa de sucção novamente. Uma vez que os potenciais de ação são visíveis, feche a linha de pressão. Estimular e registrar comodesejado. 7. Rescisão e Eliminação Uma vez que todas as gravações desejadas estão completos, mude para a respiração com 100 mg / L MS-222 até o EODC parou. Nenhuma EODC deve ser detectado durante pelo menos 10 minutos. Dispor do pescado de acordo com as diretrizes institucionais e protocolos de cuidados de animais aprovados. 8. Os resultados representativos Para a nossa aplicação em particular, estamos interessados ​​em estudar estímulo codificação por neurônios sensoriais centrais. Gravações bem sucedidas de axônios marcados permitir a análise de respostas unitárias para estimulação sensorial 18. Figura 5A mostra os potenciais de ação representativas evocadas por estimulação electrosensory transversal utilizando eletrodos bipolares localizados no interior das paredes direita e esquerda da câmara de gravação. Pico vezes pode ser apresentada como uma quadrícula trama pico (Figura 5B). A 25 ms pré-estímulo vento gravaçãoow mostra o baixo nível de atividade espontânea. Este ELA especial "small cell" é de longa passar sintonizado duração do estímulo a uma intensidade de estímulo de 6 mV / cm, aumentando o número de espigas por repetição de duração aumenta estímulo (Figura 5C). A média do primeiro pico de latência é de 4,28 ± 0,16 ms, de acordo com a latência esperada para pequenas células em ELA 11. Figura 1. Especificações para uma câmara de gravação que pode caber debaixo da objetiva de um microscópio epiflourescent fase fixa. (A) câmara de gravação quadrados para escala feitos de plexiglass mostrando superior, laterais e traseira vistas. Conjuntos de pares de eletrodos estimulantes (asteriscos) na periferia permitir ou transversal (rubro-negro) ou estimulação longitudinal (azul-amarelo). Uma peça adicional de plexiglass no canto, com um buraco de borracha alinhada no centro (laranja),mantém uma pipeta de sucção que mantém um nível de água constante. Dois postes de aço inoxidável verticais aparafusado na parte inferior da câmara (sólido verde) se conectar a postes de aço inoxidável (contorno verde) ligados à plataforma que suporte o peixe (cinza claro, detalhado na C) através de grampos de discos ajustáveis. Uma fotografia da câmara é mostrada abaixo do desenho de escala. (B) vista individuais e montados dos grampos disco circular de plástico usado para proteger a plataforma para os postes verticais. Cada grampo disco tem um sulco (verde) para um post e um orifício central para o parafuso de aperto. Disco braçadeiras são rodados de modo que os sulcos são perpendiculares uns aos outros. Apertar os parafusos (vermelho) braçadeiras os postos no lugar para evitar mais movimento de rotação vertical e da plataforma. (C) vista da frente e de lado a escala da plataforma de plexiglass usado para segurar o peixe no lugar. A plataforma é revestida com uma camada de cera de parafina (azul), que mantém Dowe madeirals (barras pretas) no local para apoiar o peixe. Tubos para respirating o peixe passa através de um furo na 'cabeceira' da plataforma e termina numa ponta de pipeta colocado na boca do peixe. Um posto de cabeça de aço inoxidável (barra cinza) se conecta à plataforma por meio de uma rótula que permite uma rotação de 360 ​​graus. Mensagens horizontais de aço inoxidável (verde) são parafusados ​​em cada extremidade da plataforma. Clique aqui para ver a figura maior . Figura 2. Visão esquemática da cirurgia olhando para a superfície dorsal da cabeça. (A) Faça quatro cortes, na ordem indicada, para remover um pedaço retangular de pele (vermelho). (B) Estender a abertura ântero para remover um pedaço retangular adicional da pele (verde). (C) Raspe qualquer gordura demais ou ligamentos pormover a lâmina de bisturi, como indicado pela seta e secar completamente a superfície com Kimwipes e ar forçado (D). Cole um borne de aço inoxidável ao crânio com supercola. Barra de escala em um aplica-se a AD. (E) Use uma broca de dentista para fazer quatro cortes, na ordem indicada, para remover um pedaço retangular de osso (azul), expondo os núcleos exterolateral anterior e posterior (ELA e ELP, respectivamente) . Clique aqui para ver a figura maior . Figura 3. Marcação fluorescente no núcleo exterolateral posterior 3 horas após a injeção do dextrano conjugado com Alexa Fluor 568. (A) Os núcleos exterolateral anterior e posterior (ELA e ELP, respectivamente) visualizado com iluminação de campo claro de cima. Notaque a mielinização extensa dentro Ela lhe dá uma aparência relativamente brilhante que a distingue de ELP. (B) A mesma área visualizada usando epifluorescência visto através de um filtro TRITC. (C) A imagem mesclada com azul para A (campo claro) e vermelho para B (TRITC). (D) Exemplo de um desenho em escala de ELA e ELP, incluindo vasos sanguíneos principais (linhas vermelhas), que podem ser usados ​​como pontos de referência para identificar a localização exata de axônios marcados visíveis apenas sob alta ampliação (a localização exata dos vasos sanguíneos varia de peixe para peixe). A linha pontilhada indica a fronteira entre ELA e ELP. (E) Exemplos de imagens obtidas utilizando um filtro TRITC de cinco preparações diferentes, ilustrando uma série de padrões de rotulagem de sucesso de pequenos axônios celulares e somas em ELA. Figura 4. Gravação extracelular única unidadea partir de um axônio rotulados. (A) eletrodo de gravação (cabeça de seta), sob pressão positiva colocada ao lado de um axônio de pequenas células rotuladas de ELA (top) registra apenas artefato borda (cabeças de seta) em resposta a um 100 ms 20 mV / cm monofásicos, , transversal pulso quadrado contralateral positivo (inferior). (B) A libertação de pressão para fora do eletrodo (cabeça de seta) faz com que o axônio para mover ligeiramente para o eletrodo (em cima), mas ainda não há respostas para o estímulo (baixo). ( C) pressão ligeiramente negativa puxa o axônio para o eletrodo (em cima, cabeça de seta) e potenciais de ação em resposta ao início do estímulo são agora visíveis (parte inferior, asterisco). Porções de fundo de todos os três painéis são respostas sobrepostas a 20 repetições do estímulo. Figura 5. Os resultados representativos usando esta técnica. (A) 5 traços da amostramostrando os potenciais de ação evocados por um 0,1 ms 6 MV / cm monofásicos, transversal estímulo pulso quadrado contralateral positivo. (B) Raster enredo mostrando momentos de pico durante 20 repetições de uma janela de gravação de 75 ms para a mesma unidade estimuladas no tempo 0, com 6 mV / cm estímulos na faixa de durações listadas à direita. (C) curva de afinação Duração quantificar as respostas apresentadas na raster como espigas por repetição de estímulo. Massa (g) Comprimento dos garfos (cm) Profundidade do corpo (cm) Significar 2,42 6.20 1.14 Desvio Padrão 0,64 0,52 0,18 Alcance 1,2-4,0 5,5-8,4 0,9-1,6 Tabela 1. Optimalpeso, comprimento e profundidade varia de corpo para os peixes. peso ideal, o comprimento do garfo (ponta do focinho até à mesa da nadadeira caudal) e corpo de profundidade (distância dorso-ventral máxima no plano transversal) varia permitindo que os peixes para caber na câmara de gravação ilustrado na Figura 1. Os peixes que são muito pequenas podem ser menos propensos a sobreviver à cirurgia e terá uma pequena ELP, tornando a colocação corante desafiador. Os peixes que são muito grandes vai ter um grande, cerebelo mais longo alcance que vai reduzir o acesso a ELA e ELP e pode impedir redução da energia, água, imersão objetivo alta perto o suficiente para se concentrar em ELA e ELP. Local de aplicação Corante Tipo Peixe tentou Etiqueta em ELA Etiqueta em ELP Unidades tentou Gravações ELum Alexa Fluor injecção 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8,0%) ELA Alexa Fluor papel de filtro embebido 1 0 0 0 0 ELA Di-me em DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0 ELA Di-O cristais 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0 ELP Alexa Fluor cristais sólidos 2 0 2 (100%) 0 0 ELP Alexa Fluor fios de tungstênio revestidos 43 <strong> 29 (67,4%) 41 (95,3%) 119 26 (21,8%) Tabela 2. As taxas de sucesso em cada método de injeção de corante. Taxas de sucesso para cada método de injeção de corante. Os métodos são divididos com base no local de injeção e tipo de corante. Para cada método, o número total de peixe e tentada a percentagem destas experiências, que resultou na marcação com êxito em ELA e ELP é mostrado. Note-se que a área de gravação alvo é o oposto do local de aplicação (caixas em negrito). Para o local da injeção, a absorção do corante foi considerada bem-sucedida com a rotulagem de ambos somas e axônios. Em contraste, no local da gravação, apenas preparados com axónios marcados foram contadas como experiências de marcação bem sucedidas. O número total de tentativas de unidades e a percentagem destas unidades, que resultou em gravações bem sucedidas são também mostrados. # Da injeção de sites Volume médio por injeção (mL) Gama de volumes por injeção (mL) Volume de injeção total médio (mL) Gama de volumes de injeção totais (mL) Microinjetor com Hamilton 3 ou 4 0,144 ,091-0,91 0,516 0,378-0,669 Nanoinjector com vidro pipeta 2-4 0.069 (fixo) Volume fixo injetado 1-6 vezes 0,621 0,414-0,966 Microinjetor com vidro pipeta 2-6 0.093 0,058-0,202 0.360 ,252-,540 Tabela 3. Quantidades de corante aplicado para cada um dos três métodos utilizados para injectar Alexa Fluor em ELA Quantidades de corante aplicadas para cada um dos três métodos utilizados para injectar Alexa Fluor em ELA (primeiro método a partir da Tabela 2). Injecção de corante em ELA foi realizada tanto com um nanoinjector e um microinjector utilizando uma agulha de calibre 33 de Hamilton seringa ou uma pipeta capilar de vidro puxado. Nós variou o número de locais de injecção, o volume por injeção eo volume total de injeção de corante.