Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.
Nós descrevemos uma estratégia inovadora para visualizar os componentes do plasma tráfico proteína de membrana. A abordagem combinatória de fotodegradação técnicas com a proteína SEP-tag permite seletivamente eventos de inserção da membrana plasmática para ser avaliado. Continuamente fotobranqueamento as proteínas da membrana em regiões acompanhamento durante a recuperação, o método 'FRAP-FLIP "avalia a contribuição do tráfico vesicular para a recuperação de fluorescência. Esta nova abordagem permite a gravação directa de inserção de proteína de membrana, permitindo que tanto o número de sub-compartimentos em que a recuperação é observado e da amplitude da recuperação (Af), no estado estacionário a ser determinado. Além disso, a comparação de FRAP com e sem FLIP permite a proporção de recuperação atribuível a difusão lateral de ser calculados.
Além disso, na mesma experiência, as regiões de não-Foto-descoloração dendrite adjacente às regiões flanqueadoras Foto-descoloração pode seravaliados qualitativamente durante a recuperação, a perda de fluorescência observada nestas regiões será devido à difusão lateral dos receptores Foto-descoloração para esses segmentos não-Foto-descoloração do dendrito.
Este protocolo selectiva fotobranqueamento pode ser utilizada para investigar uma variedade de processos celulares, tais como o tráfico caracterizando excocytosis na membrana plasmática em subáreas definidos (por exemplo, dendritos ou espinhas) FRAP ou avaliar a contribuição da inserção lateral, difusão através da realização de vs FRAP paralelo e ' protocolos-FLIP 'ao longo dendritos adjacentes (Fig. 3).
É evidente que, embora as orientações específicas foram apresentados, cada laboratório será necessário otimizar os parâmetros de imagem de acordo com amostras e equipamentos específicos. Importante, todos os receptores de superfície no ROI precisa ser Foto-descoloração, independente do plano z eixo focal, mas sem danos fototóxico significativa ou não-específica fotobranqueamento. NosERS deve ter cautela ao tentar este protocolo na soma das células, como a elevada percentagem de compartimentos de pH relativamente baixos intracelulares normalmente resulta em fluorescência de fundo de alta nestas regiões. Além disso, enquanto que tenhamos demonstrado como esta técnica pode ser aplicada em varia maneiras, antes de iniciar selectivos experiências fotobranqueamento sobre um novo SEP-etiquetados construir, aconselha que uma caracterização inicial dos receptores marcados é primeiro conduzido, tal como descrito por Ashby et ai 2.
Em geral, este método é uma adaptação potente e versátil do protocolo FRAP padrão, permitindo que os eventos de inserção na membrana de plasma a ser avaliada em tempo real.
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos a Wellcome Trust e do CEI pelo apoio financeiro. IMGG é um Fellow EMBO. KLH é uma BBSRC financiado pela estudante de doutorado. Agradecemos Philip Rubin e Patrick Tidball de apoio técnico e cultura celular e Andrew Dr Doherty para a manutenção e assistência com os microscópios.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
24mm glass coverslips | VWR International | 631-0161 | |
Poly-l-lysine | Sigma | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
Penicillin Streptomycin | Sigma | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
LSM510 META confocal system | Zeiss | ||
Image J Software | NIH | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |