Ce rapport décrit l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes et des techniques de photoblanchiment pour déterminer l'expression de surface, les voies de transport et de la cinétique du trafic de manière exogène exprimé, sensible au pH GFP-protéines marquées à la membrane plasmique des neurones.
Nous décrivons une stratégie novatrice de visualiser les composants de la traite plasma protéine de la membrane. L'approche combinatoire de photoblanchiment techniques avec des protéines SEP-étiqueté permet sélectivement les événements plasma membrane d'insertion à être évaluée. En permanence photoblanchiment des protéines membranaires dans des régions adjacentes lors de la récupération, la méthode du «FRAP-FLIP» évalue la contribution du trafic vésiculaire à la récupération de fluorescence. Cette nouvelle approche permet l'enregistrement direct de l'insertion des protéines membranaires, permettant à la fois le nombre de sous-compartiments dont le recouvrement est observé et l'amplitude de la reprise (AF) à l'état stationnaire à déterminer. En outre, la comparaison de PAF avec et sans FLIP permet la proportion de recouvrement attribuable à la diffusion latérale à être calculée.
En outre, dans la même expérience, les régions de non-photobleached dendrite adjacente aux régions flanquantes photobleached peut êtreune évaluation qualitative lors de la reprise, la perte de fluorescence observée dans ces régions sera en raison de la diffusion latérale des récepteurs photobleached dans ces segments non-photobleached de la dendrite.
Ce protocole sélective photoblanchiment peut être utilisée pour étudier une variété de processus cellulaires tels que le trafic caractérisant excocytosis dans la membrane plasmique dans les sous-zones définies (par exemple, les dendrites ou épines) FRAP ou d'évaluer la contribution de l'insertion de diffusion vs latérale en effectuant en parallèle et des FRAP -FLIP »le long des dendrites protocoles adjacents (Fig. 3).
De toute évidence, tandis que les directives spécifiques ont été présentés, chaque laboratoire devra optimiser les paramètres d'imagerie selon les spécimens spécifiques et des équipements. Important, tous les récepteurs de surface dans la ROI doivent être photobleached, indépendante du plan z-axe focal, mais sans endommager phototoxique significative ou non spécifique photoblanchiment. NousERS devrait faire preuve de prudence lorsque l'on tente ce protocole à le corps cellulaire, comme le pourcentage élevé de compartiments intracellulaires de pH relativement faible se traduit généralement par fluorescence de fond élevé dans ces régions. En outre, tandis que nous avons montré comment cette technique peut être appliquée de diverses manières, avant de commencer les expériences de photoblanchiment sélectifs sur une nouvelle SEP-étiqueté de construire, nous vous informons que la caractérisation initiale des récepteurs marqués est d'abord menée, tel que décrit par Ashby et al 2.
Dans l'ensemble, cette méthode est une adaptation puissante et polyvalente du protocole FRAP standard, permettant des événements d'insertion dans la membrane plasmique à être évalués en temps quasi réel.
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants à la Wellcome Trust et l'ERC pour un soutien financier. IMGG est un Fellow EMBO. KLH est un étudiant BBSRC financé par un doctorat. Nous remercions Philip Rubin et Patrick Tidball pour le soutien de la culture technique et la cellule et le Dr Andrew Doherty pour l'entretien et l'assistance avec les microscopes.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
24mm glass coverslips | VWR International | 631-0161 | |
Poly-l-lysine | Sigma | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
Penicillin Streptomycin | Sigma | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
LSM510 META confocal system | Zeiss | ||
Image J Software | NIH | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |