Summary

Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion

Published: March 28, 2012
doi:

Summary

Mechanosensorischen Haarzellen sind die Sinneszellen des Innenohres. Der am besten charakterisierte<em> In-vitro-</em> Modell-System von Säugetieren reifen Haarzellen nutzt Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen. Wir präsentieren die Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus, und wir zeigen Adenovirus-vermittelte Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche.

Abstract

Schwerhörigkeit und Gleichgewichtsstörungen werden oft durch den Tod von mechanosensorischen Haarzellen, die die Sinneszellen im Innenohr verursacht werden. Da es keine Zelllinie, die zufriedenstellend für Säuger-Haarzellen setzt Forschung Haarzellen auf Hauptorgan Kulturen. Die in vitro-Modellsystem von reifem Säuger Haarzellen am besten charakterisierte verwendet Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen (1) 1-6. Der Utriculus ist ein Gleichgewichtsorgan, und die Haarzellen des Utriculus sind ähnlich in Struktur und Funktion der Haarzellen im Hörorgan, das Corti-Organ. Die erwachsenen Maus Utriculus Vorbereitung stellt eine reife Sinnesepithel für Studien über die molekularen Signale, die das Überleben, Homöostase und Tod dieser Zellen zu regulieren.

Mammalian Haarzellen der Cochlea sind terminal differenziert und werden nicht regeneriert, wenn sie verloren sind. In Nicht-mammalischen Wirbeltiere, auditive oder vestibuläre Haarzelle der Tod durch robuste Regeneration, die Gehör und Gleichgewicht Funktionen 7, 8 wieder gefolgt. Haare Zellregeneration wird durch Glia-wie Stützzellen, die die basolateralen Oberflächen der Haarzellen in der Sinnesepithel 9, 10 Kontakt vermittelt. Stützzellen sind auch wichtige Mediatoren der Haarzelle Überleben und Tod 11. Wir haben vor kurzem eine Technik für die Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche Verwendung von Adenovirus entwickelt. Verwendung von Adenovirus Typ 5 (dE1/E3), ein Transgen enthält GFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors zu liefern, finden wir, dass Adenovirus-spezifisch und effizient infiziert Stützzellen. Unterstützende Zellinfektion ein Wirkungsgrad von ca. 25-50%, und Haarzellen nicht infiziert sind (Abbildung 2). Wichtig ist, finden wir, dass adenovirale Infektion von Stützzellen nicht in die Toxizität für Haarzellen oder Stützzellen führen, da Zellzahlen in der Ad-GFP-infektieren Primordialschläuche denen entsprechen, die in nicht-infizierten Primordialschläuche (Abbildung 3). So Adenovirus-vermittelten Genexpression in Stützzellen des kultivierten Primordialschläuche ist ein leistungsstarkes Tool, um die Rollen von Stützzellen als Vermittler der Haare das Überleben der Zelle, Tod und Regeneration zu studieren.

Protocol

1. Utriculus Dissection und Kultur Euthanize einen Erwachsenen (4 Wochen alt oder älter) Maus unter Verwendung eines zugelassenen Protokoll und enthaupten. Snip den äußeren Gehörgang auf beiden Seiten des Kopfes und ziehen Sie die Haut nach vorn in Richtung der Nase. Halbierung der Kopf von hinten nach vorne und entfernen Sie das Gehirn von beiden Seiten, um die knöchernen Labyrinth zu offenbaren. Kürzen Sie den Schädel weg von der knöchernen Schnecke und überweisen Sie den knöch…

Discussion

Sensorischen Haarzellen sind anfällig für den Tod von einer Vielzahl von Belastungen, einschließlich Altersstruktur, Knalltrauma, und der Exposition gegenüber ototoxischen Medikamenten, einschließlich der Aminoglykosid-Antibiotika und der Antineoplastikum Cisplatin verursacht. Bei Säugetieren Haare Zelltod führt zu permanentem Hörverlust und / oder Störung Gleichgewicht. In-vitro-Modellsysteme sind entscheidende Werkzeuge für das Studium an der Bestimmung der zellulären und molekularen Mechanismen, d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung am National Institute on Taubheit und andere Kommunikations Erkrankungen unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von NIDCD 5R01 DC007613 zur Verfügung gestellt.

Materials

Reagent Company Catalog number
Medium 199 Gibco/Invitrogen 12350
DMEM/F12 Gibco/Invitrogen 11320
Fine forceps (#55) Fine Science Tools 11255-20
Fine forceps (#5) Fine Science Tools 11252-30
Forceps (#3) Fine Science Tools 11231-30
Penicillin G Sigma P3032
Fetal bovine serum Invitrogen 10082-139
Nunc mini-tray Fisher 12-565-68
Adenovirus-GFP Vector Biolabs 1060*
Cal-Ex decalcifier Fisher CS510-1D
sodium borohydride Sigma 452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal) Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal) Developmental Studies Hybridoma Bank MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin Sigma C 3545
Anti-Calbindin Chemicon AB1778
Fluoromount G Southern Biotechnology Associates 0100-01

Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.

* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.

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Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. J. Vis. Exp. (61), e3734, doi:10.3791/3734 (2012).

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