Die<em> Drosophila</em> Ei Kammer ist ein ausgezeichnetes Modell für die Erforschung der Mechanismen der mRNA-Lokalisierung. Um die dynamische Ereignisse, die die Prozesse der Lokalisierung untermauern zu erfassen, ist eine schnelle hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe erforderlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Bildgebung von Live-Proben mit minimalen Unterbrechungen.
Live Cell Imaging ist eine wichtige Technik angewendet, um eine Reihe von Drosophila Gewebe als Modelle verwendet, um Themen wie Achsen-Spezifikation, die Zelldifferenzierung und Organogenese 1 zu untersuchen. Richtige Vorbereitung der experimentellen Proben ist ein wichtiger, jedoch oft vernachlässigte Schritt. Das Ziel der Vorbereitung ist es, physiologische Relevanz zu gewährleisten und optimale Aufnahmebedingungen zu schaffen. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten, ist es entscheidend zu Dehydratation, Hypoxie, Überhitzung oder Verschlechterung Medium 2 zu vermeiden.
Die Drosophila-Ei Kammer ist ein gut etabliertes System zur Prüfung von Fragen im Zusammenhang, aber nicht beschränkt, um Körper Musterung, mRNA Lokalisation und Organisation des Zytoskeletts 3,4. Für Early-und Mid-Stage Ei Kammern, die Montage in Halocarbonöl ist gut für das Überleben, dass es freie Diffusion von Sauerstoff ermöglicht, verhindert das Austrocknen und Hypoxie und verfügt über hervorragende optische Eigenschaften für die Mikroskopie. ImAlterung der fluoreszierenden Proteinen besteht in der Einführung von Transgenen in das Ei Kammer oder physikalische Injektion von markierten RNA-, Protein oder Antikörper 5-7 möglich. Zum Beispiel erlaubt die Aufnahme MS2 Konstrukte in das Genom von Tieren Echtzeit-Beobachtung von mRNAs in der Eizelle 8. Diese Konstrukte können für in vivo-Markierung von mRNA durch Nutzung des MS2-Bakteriophagen-RNA-Stammschleife Interaktion mit dem Hüllprotein 9.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Extraktion von Eierstöcken sowie Isolierung einzelner Ovariolen und Ei Kammern aus der weiblichen Drosophila. Für eine detaillierte Beschreibung von Drosophila Oogenese siehe Allan C. Spradling (1993, neu aufgelegt 2009) 10.
Live Cell Imaging ist ein leistungsfähiges Assay zur Untersuchung zellulärer Prozesse in Echtzeit. Neben der einfachen Hellfeld-Beobachtung hat der Zusatz von fluoreszierenden Markierungen an Proteine und RNAs von Interesse führen zu vielen Durchbrüchen. Hier haben wir ein Protokoll für die Bildgebung individuelles Wohnen Eizellen, die in Kombination mit genetischen und biochemischen Assays genutzt werden können umrissen.
In diesem Protokoll auch erklären, wie experimentell zu manipulieren lebenden Oozyten durch Injektion. Es gibt viele Möglichkeiten für das Material zu injizieren, einschließlich In-vitro synthetisiert fluoreszenzmarkierten RNA-Assay die Fähigkeit einer sekundären Struktur, um direkte RNA Körperregion (Ball und Davis, unveröffentlicht) und Antikörper, die die Funktion von Proteinen 6 inhibieren. Zukünftige Arbeiten werden wahrscheinlich sehen die Einführung anderer Etikettierung Komponenten und zelluläre Maschinerie zur lebenden Eizellen ermöglichen molekularen Mechanismen zu testen.
t "> Die Erhaltung der Rentabilität und Lebensfähigkeit des Gewebes ist von wesentlicher Bedeutung bei der Arbeit mit lebenden Zellen. In diesem Protokoll, weisen wir darauf hin eine Reihe von Schritten, die auf Stress des Eies Kammer führen kann. Zum Beispiel, trotz Öl überlegen for Imaging, erweiterte Kulturbegriff in der Öl kann dazu führen, auf dem Ei Kammer zu betonen. Dies kann leicht unter Hellfeld Belichtung werden durch Untersuchung des Zellkerns und Position, Membran, die Eizelle zu verzerren und wird bleb unter Stress (vgl. Abbildung 7E (unbelasteten) zu Figure7F überwacht werden ( betonte)). Stage 9 Eikammern zeigen RNA Lokalisation und Grenze Zellmigration 12 über mehrere Stunden. jedoch ein Stadium 8.7 Eikammer beginnt zu negativen Auswirkungen in Halo Kohlenstoff Öl nach etwa 40 Minuten von den Eierstöcken entfernt von dem weisen weiblich. Spätstadium Eikammern, Stufe 11 bis 14, kann sich normal entwickeln entweder in Öl oder wässrigen Medien wegen der Sekretion der Eischale von den Follikelzellen in diesen Phasen 13. Es war Reported, dass die Zugabe von Insulin zu wässrigen Medium Insekten-Stufe 9 Oozyten bis zu 6 Stunden 14 und germaria bis zu 14 Stunden 15 aufrechtzuerhalten. In allen Fällen sollten aggressive Manöver des Eies Kammer vermieden werden, da sie die Eizellen betont und reduziert seine Lebensfähigkeit. Imaging weniger Ei Kammern und darauf achten, dass jeder vorsichtig zu behandeln ist der beste Weg, um eine optimale Rentabilität zu gewährleisten.The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Research Fellowship an I. Davis unterstützt.
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Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
Dry active yeast | Fleischmann’s Yeast | #2192 |