עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר
Summary
בדו"ח זה אנו מתארים שיטה למחוץ העצב העכבר הנשה. שיטה זו משתמשת מלקחיים עוצר דמום זמינים ובקלות reproducibly מייצרת העצב המלא למחוץ הנשה. בנוסף, אנו מתארים שיטה להכין mounts שרירים שלמים מתאימים לניתוח של התחדשות עצבים אחרי למחוץ גיד הנשה.
Abstract
הדור הבא של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) נלמדת באופן נרחב גם על הרלוונטיות שלה למחלות האדם להבין את התגובה משובי חזקים רכוב על ידי נוירונים PNS ובכך אולי שהאירו את הכישלונות של התחדשות מערכת העצבים המרכזית 1. למעוך גיד הנשה (axonotmesis) הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר של פגיעה עצבית היקפית במכרסמים 2. ריסוק קוטע את כל האקסונים אלא רבדים שוואן התאים הבזליים נשמרים כך התחדשות כי הוא אופטימלי 3,4. זו מאפשרת לחוקר לבחון דווקא את היכולת של האקסון הגוברת לקיים אינטראקציה עם התא הן שוואן ואת רבדים הבסיס 4. החולדות היו בדרך כלל את הדגמים המועדפים על בעלי חיים למחוץ העצב ניסיוני. הם זמינים באופן נרחב ועל גיד הנשה lesioned שלהם מספק קירוב סביר של נגעים עצב אנושיים 5,4. אם כי קטנים יותר מאשר עצב חולדה, עצב העכבר יש תכונות דומות רבות. והכי חשוב אם כי, mousמודלים אלקטרוניים הם בעלי ערך יותר ויותר בגלל הזמינות רחב של קווי מהונדס כעת מאפשרת לנתיחה מפורט של מולקולות בודדות קריטיים עבור התחדשות עצבים 6, 7. חוקרים קודמים השתמשו בשיטות רבות כדי לייצר דלוקה עצב או פציעה כולל מלקחיים זווית פשוטים, מלקחיים, מלקחיים מצוננים עוצר דמום, Clamps כלי הדם, וכן החוקר מלחציים, שנועדו 8,9,10,11,12. החוקרים השתמשו גם שיטות שונות של סימון האתר כולל פגיעה תפר, חלקיקי פחמן חרוזי ניאון 13,14,1. אנו מתארים את השיטה שלנו להשיג דלוקה מלאה reproducibly גיד הנשה עם סימון מדויק ועקבי של האתר, למעוך בעזרת מלקחיים עוצר דמום דקים פחמן לאחר המדליקה האתר סימון. במסגרת תיאור שלנו הליך גיד הנשה למחוץ כללנו גם שיטה פשוטה יחסית של כל שריר לעלות לאחר מכן אנו משתמשים כדי לכמת התחדשות.
Protocol
Discussion
הצגנו שיטה להשיג דלוקה מלאה ומהימנה גיד הנשה עם סימון מדויק של אתר דלוק. כאמור, למעוך גיד הנשה הוא מודל נפוץ של פגיעה עצבית היקפית בעכברים וחולדות. למרות כל שיטה של התאהבות יש יתרונות וחסרונות, מצאנו שיטה זו הופק דלוקה שלמה סומן בקלות עם מינימום של ציוד מיוחד (מלחצי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH K08NS065157 (כדי TAF) בנוסף, מרכז פן על צ'כית, מספר פרס P30AR050950 מן המכון הלאומי של דלקת פרקים, מחלות השלד והשרירים והעור נתמך בעבודה זו (TAF וסטיבן ס 'שרר). לבסוף, שריינרים ילדים מרכז המחקר זרע מימון (TAF) נתמך על העבודה הזאת. ברצוננו להודות לד"ר יאנג, ג'ין בן עבור בתחילה הוכחת הר ההליך כולו ואיימי א 'קים על עזרתה בהפקת סקיצות של איור 1.
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
References
- Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
- Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).
- Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).
- Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28, 458-470 (2008).
- Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).
- Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse – adaptation of the sciatic static index. J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).
- Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. Standardized crush injury of the mouse median nerve. J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).
- Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion. Neuroreport. 21, 782-785 (2010).
- Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve. Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).
- Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse. BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).
- Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve. J. Anat. 206, 69-78 (2005).
- Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp. J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).
