We beschrijven een alternatieve benadering voor de opsomming van mycobacteriën<em> In vitro</em>, Die reporter-gen maakt gebruik van gelabeld mycobacteriën in plaats van kolonievormende eenheden (CFU). "Overleven" van organismen als gastheer response-markers worden gelijktijdig gemeten, het verstrekken van een low-cost, veelzijdig en functioneel systeem voor de studie van gastheer / pathogeen interacties in de context van tuberculose.
Functionele testen al lang een belangrijke rol gespeeld bij het meten van de immunogeniciteit van een bepaald vaccin. Dit wordt conventioneel uitgedrukt als serum bactericide titers. Studies van serum bactericide titers in reactie van vaccins voor kinderziekten hebben ons in staat te ontwikkelen en cut-off te valideren niveaus voor beschermende immuunrespons en dergelijke cut-offs zijn in routine gebruik. Dergelijke testen zijn naar voren opgenomen in de routine evaluatie van de vaccins die in de eerste plaats cel-gemedieerde immuniteit in de vorm van effector T-cel responsen, zoals tuberculose vaccins induceren. In het diermodel, is de prestatie van een bepaalde kandidaat-vaccin regelmatig geëvalueerd in gestandaardiseerde bactericide testen, en alle huidige nieuwe TB-vaccin kandidaten zijn onderworpen aan deze stap in de evaluatie voorafgaand aan een menselijke proeven fase. De beoordeling van de immunogeniciteit en daarom de waarschijnlijkheid van beschermende werkzaamheid van nieuwe anti-TB-vaccins moet een soortgelijke stapsgewijze evaluatie idealiter nu ondergaan in de menselijke modellen, inclusief metingen in bactericide assays.
Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn al goed ingeburgerd in de diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit. Er zijn echter geen dergelijke tests zijn verwerkt in klinische studies voor nieuwe anti-TB vaccins tot nu toe.
Hoewel er nog steeds onzekerheid over de precieze mechanismen die leiden tot het doden van mycobacteriën in de menselijke macrofagen, is de interactie van macrofagen en T-cellen met mycobacteriën duidelijk nodig. De test beschreven in dit document vertegenwoordigt een nieuwe generatie van bactericide testen die studies van dergelijke belangrijke cellulaire componenten mogelijk maakt met alle andere cellulaire en humorale factoren aanwezig zijn in bloed, zonder het maken van veronderstellingen over de relatieve individuele bijdrage. De assay beschreven door onze groep maakt gebruik van kleine hoeveelheden van bloed en is al toegepast in studies met volwassenen en kinderen in TB-endemische instellingen. We hebben laten zien immunogeniciteit van het BCG-vaccin, de toegenomen groei van mycobacteriën bij HIV-positieve patiënten, evenals het effect van anti-retrovirale therapie en vitamine D op mycobacteriële overleving in vitro. Hier vatten we de methodologie, en presenteren onze reproduceerbaarheid gegevens met behulp van dit relatief eenvoudige, goedkope en veld-vriendelijke model.
Let op: Definities / Afkortingen
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal stam, getransformeerd met plasmide shuttle pSMT1 het dragen van de luxAB genen van Vibrio harveyi, onder de controle van de mycobacteriële GroEL (HSP60) promotor.
CFU = Colony Forming Unit (een maat voor mycobacteriële levensvatbaarheid).
Bactericide assays in het kader van tuberculose vaccins onderzoek zijn goed ingeburgerd in diermodellen, waar ze worden toegepast op potentieel veelbelovende kandidaat-vaccins scherm. Reductie van bacteriële belasting in verschillende organen fungeert als de belangrijkste uitlezen van immunogeniciteit.
De eerste generatie van de menselijke bactericide assays werden ontworpen met behulp van macrofagen alleen, die besmet zijn met M. tuberculose. CFU diende als de belangrijkste uitlez…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door persoonlijke beurzen van de Wellcome Trust Beate Kampmann (056.608, GRO77273).
Reagent | Company | Cat No |
BCG lux | Various | n/a |
Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
Sterile PBS | In House | n/a |
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
Sterile distilled Water | In House | n/a |
Equipment | ||
Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
10ml pipettes and pipette boy | any | |
1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
General laboratory equipment: | ||
Class II safety cabinet cabinet | ||
Refrigerator (4°C) | ||
Centrifuge | ||
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |