Transformación y cercarias In vitro El cultivo de la Schistosoma mansoni Schistosomules

Las medidas de seguridad: Cercarias esquistosoma puede penetrar directamente en la piel sin las necesidades de un corte o los poros y causa la esquistosomiasis enfermedades crónicas. S. mansoni es un nivel de bioseguridad 2 organismo, por lo tanto, el equipo de protección personal y las medidas de seguridad se deben seguir cuando se trabaja con cercarias infecciosas. La mayoría de los equipos necesarios para crecer y transformar la esquistosomiasis es estándar, con algunas excepciones clave pocas indica en la tabla al final del protocolo. Todo el trabajo de cercarias se debe hacer en una habitación aislada. Schistosomules deben ser cultivadas en una campana estéril, aprobado bioseguridad. Dos capas de nitrilo o guantes de látex deben ser usados, así como una bata de laboratorio, resistente al agua un par de zapatos, pantalones sin agujeros o rasgones, y protectores a prueba de agua la manga para las muñecas y los brazos. En el caso de un derrame accidental, pulverizar inmediatamente el área contaminada con etanol al 70% o 10% de lejía, frotar vigorosamente si en su persona. Esto será suficiente para desactivar el parásito, pero todas las posibles infecciones deben ser informados y tomados en serio. Aunque schistosomules no son netamente infeccioso, las directrices institucionales varían, y debe ser consultado para determinar si BSL2 precauciones son necesarias durante las etapas de la vida no infecciosas. Desinfecte todas las superficies que entran en contacto con cualquier sustancia potencialmente infecciosos después de que el experimento se lleva a cabo y deseche los residuos en un contenedor de riesgo biológico aprobado. NOTA: la cubierta contenedores caracol 1 a 2 días antes de su vertimiento y protegerlo de la luz 1. La recolección de las cercarias caracol Llene un vaso limpio, libre de 500 ml de detergentes medio llena con agua destilada equilibrarse a temperatura ambiente. Si se trabaja con los caracoles huésped infectado con miracidios en fechas diferentes, utilizar un vaso para cada fecha de la infección (Esto es especialmente importante si los caracoles serán reutilizados para futuros experimentos). El tamaño del vaso también puede ser menor dependiendo de la experiencia del usuario. Recoge los huéspedes infectados caracol que desea arrojar y depositar con cuidado en el vaso con un pez de acuario estándar de red y las pinzas de uso general, según sea necesario. Colocar en un vaso de precipitados de emergencia para derrames bandeja de aproximadamente 8 a 12 pulgadas por debajo de una fuente de luz incandescente. Deje reposar durante 1-2 horas a la luz. Cercarias salir del caracol cuando se expone a la luz brillante. Cuidadosamente filtra los caracoles de la mezcla de cercarias. Tome las precauciones de seguridad adicionales, como una mezcla es altamente infecciosa. Recuerde, cercarias directamente pueden penetrar la piel humana! Vuelva a colocar la mezcla en la fuente de luz durante unos 15 minutos, permitiendo que cualquier material de desecho de partículas se asienten. Transferencia de cercarias en un erlenmeyer limpio usando una pipeta, evitando la suciedad en el fondo del vaso. Colocar el matraz aproximadamente a un ángulo de 45 ° sobre el hielo en la oscuridad durante 45 – 60 minutos, lo que permite cercarias para establecerse en una esquina. Utilice una pipeta de 50 mL para eliminar 75 a 90% del sobrenadante y depositarlo en el vaso que contiene lejía al 10% o 70% de etanol, teniendo cuidado de no dejar que las gotas de agua que contienen cercarias por goteo de la pipeta. Agitar el matraz Erlenmeyer que contiene cercarias suavemente para volver a suspender las cercarias en la solución. Use una pipeta para transferir la muestra a la estéril tubos de 50 ml cónicos. Coloque los tubos de nuevo en hielo durante 20 minutos en la oscuridad. Cercarias se depositarán en el fondo del tubo en la oscuridad. 2. Transformación manual de cercarias al schistosomules Antes de empezar: Asegúrese RPMI 1640 completo (RPMI, el 5% de suero fetal bovino, 1X penicilina / estreptomicina) y calentar a 37 º C. (Es muy importante que el suero fetal bovino utilizado ha sido inactivada por incubación a 56 ° C durante 1 hora como esquistosomas pueden ser sensibles al complemento). En una campana de riesgo biológico, eliminar el sobrenadante a un 5 a 10 ml de solución en cada uno cónico de 50 ml con una pipeta o un dispositivo de vacío. Adjunte una de calibre 22 de doble punta, luer lok emulsionante aguja a una jeringa de tamaño adecuado. Dibujar lentamente la mezcla en la jeringa. Recoger cercarias de todos los tubos de 50 ml en una jeringa. Esté atento de goteo. Con cuidado, gira la jeringa sobre manera que el extremo aguja separada está para arriba. Añada otra jeringa a este lado de la aguja emulsionante. Pase la mezcla a través de la aguja de un total de 40 veces (20 veces de ida y vuelta) para transformar las cercarias. La posición de la jeringa verticalmente de manera que la mezcla está contenida en la jeringa y la parte inferior de la jeringa superior está vacía. Retire la jeringa encima y desinfección en el 70% de etanol. Fuerte caída de la mezcla a gota en un recipiente limpio de alta amurallada plato 100mm x 50mm pyrex o cristalizador. Desinfectar agujas y jeringas en un 70% de etanol. Añadir 37 ° C medio RPMI 1640 completo de manera que elparte inferior de la placa de Petri está totalmente cubierta, como si el vertido de un plato de caldo de Luria. Hágalo girar suavemente para recoger schistosomules en el centro de la placa de Petri. Evitar salpicaduras. Nota: Puede ser útil para apagar la luz de campana para dar este paso para visualizar más adecuadamente la schistosomules en el centro. Inmediatamente depósito schistosomules concentrado en un nuevo máximo de 12 y placa de cultivo celular y mediante un gotero estéril. Repetir 2.9 y 2.10 hasta schistosomules ya no están presentes en el centro del plato (aproximadamente 10 veces). Depósito de cada uno posterior recogida en un lugar bien fresco. Llene cada uno bien hasta la mitad (alrededor de 1,5 ml) precalentado con medio RPMI completo. Visualizar en un microscopio invertido para verificar la presencia de schistosomules y la ausencia de cercarias. Crecimiento de la schistosomules en una incubadora de CO 2 fijado a 37 ° C y 5% de CO 2. 3. Los resultados representativos: Transferencia pendiente de schistosomules transformado en medios de cultivo, la visualización en una brillante invertido microscopio de campo (ver tabla de equipos para un ejemplo) debería dar una imagen similar a la Figura 1, en el que sólo schistosomules transformado están presentes en el pozo. Los contaminantes potenciales podrían incluir cercarias intacto, cortó las colas de cercarias, u otros desechos. Si no se dispone de microscopio invertido, un microscopio estándar o incluso un alcance disección será suficiente para visualizar el schistosomules. Tenga en cuenta que este procedimiento no siempre es transformar el 100% de cercarias. Figura 1: Transformada schistosomulum Figura 2: Ruptura de las colas y Cercariae