Cercarial 변화와 체외에서 양성 Schistosoma mansoni Schistosomules

안전 대책 : Schistosome cercariae 직접 절단이나 모공의 필요없이 피부를 침투하고, 만성 질병 주혈흡충증 (기생충병)가 발생할 수 있습니다. S.은 mansoni는 biosafety 레벨 2 생물, 따라서 적절한 개인 보호 장비이며, infective의 cercaria 작업을 할 때 적절한 안전 조치가 따라야한다. schistosomes을 성장하고 변화하는 데 필요한 장비의 대부분은 프로토콜의 끝에있는 테이블에 명시된 바와 같이 몇 가지 중요한 예외와 함께, 표준입니다. 모든 cercarial 작품은 외딴 방에서 수행되어야합니다. Schistosomules는 살균, 승인 biosafety 후드에 교양하여야한다. nitrile 또는 라텍스 장갑 두 레이어는 착용한다로 실험실 외투, 신발의 방수 쌍, 손목과 팔을 구멍이나 눈물, 그리고 방수 슬리브 보호 장치와 함께 바지를해야합니다. 사고 유출의 경우, 즉시 적극적으로 당신의 사람에 경우 바르고, 70 % 에탄올 또는 10 %의 표백제로 오염된 지역을 스프레이. 이것은 기생충을 해제 충분하지만, 가능한 모든 감염은보고 심각하게 이동해야합니다. schistosomules가 innately infective 아니지만, 제도적 지침 다양하고, BSL2주의가 noninfectious 생활 단계 동안 필요한지 여부를 확인할 수 협의해야합니다. 실험이 승인된 생물 학적 컨테이너에서 수행하고 폐기물을 폐기 후 모든 잠재적으로 전염성 물질과 접촉에 와서 모든 표면을 소독. 참고 : 표지 달팽이 호스트 용기 1-2일 사전 흘리기와 빛으로부터 보호하기 위해 1. 달팽이 호스트에서 cercariae 수확 실내 온도 equilibrated 증류수와 중간 전체 세제 무료로 깨끗하고, 500mL 비커를 입력합니다. 다른 날짜에 miracidia 감염된 호스트 달팽이와 함께 일하고있다면, (달팽이가 이후의 실험에 대한 재사용 될 경우 이것은 특히 중요합니다) 각 감염 기간에 대한 별도의 비이커를 사용합니다. 비커의 크기는 또한 사용자의 경험에 따라 작은 수 있습니다. 당신은 필요에 따라 네트워크 표준 수족관 물고기, 일반 목적의 집게를 사용하여 비이커에서 그들을 창고 조심스럽게 입금하고자하는 감염된 달팽이 호스트를 수집합니다. 비상 노출에 대한 플레이스 비커는 백열 광원 아래 약 8-12인치을 트레이. 불빛 아래 1-2시간에 대한있게 해줘요. 밝은 빛에 노출되면 Cercariae는 달팽이 호스트를 종료합니다. 조심스럽게 cercariae 혼합물에서 달팽이를 필터링합니다. 혼합물은 매우 전염성이므로, 별도의 안전 조치를 가져가라. 기억 cercariae 직접 인간의 피부를 뚫을 수 있습니다! 어떤 입자의 쓰레기 문제 해결 수 있도록 약 15 분 동안 광원에 따라 혼합물을 교체하십시오. 비커의 하단에있는 파편을 피하기 위해, pipet을 사용하여 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크에 cercariae을 전송합니다. 60 분 cercariae 한 구석에 정착 있도록 – 45 어둠 속에 얼음에 약 45 ° 각도로 술병를 놓습니다. 뜨는의 75-90%를 제거하고 10 % 표백 제나 70 % 에탄올을 포함하는 비커에 입금, 물 방울이 pipet에서 cercariae의 드립을 포함하도록하지 간병하기 위해 50 ML의 pipet을 사용합니다. 소용돌이 Erlenmeyer 플라스크는 솔루션 cercariae을 resuspend을 부드럽게 cercariae을 포함. 무균 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 전송하는 pipet을 사용합니다. 어둠 속에서 20 분간 얼음에 다시 튜브를 삽입합니다. Cercariae는 어둠 속에서 튜브의 아래쪽으로 해결됩니다. 2. schistosomules에 cercariae의 수동 변환 당신이 시작하기 전에 : RPMI 1640 완료 (RPMI 5 % 태아 소 혈청, 1X 펜 / Strep)와 37 ° C.에 따뜻한 확인 (그것은 사용되는 태아 소 혈청이 배양에 의해 inactivated했다는 중요합니다 56 ° C schistosomes가 보완에 민감 수 있으므로 1 시간). 생물 학적 후드에서 pipettor 또는 진공 장치를 사용하여 각 50 ML 원뿔의 솔루션 5-10 ML로 뜨는 제거합니다. luer 록이 적절하게 크기 주사기에 바늘을 emulsifying 두 번 끝난 22 게이지를 부착합니다. 천천히 주사기에 혼합을 그립니다. 주사기 50 ML 튜브에서 cercariae를 수집합니다. 흘리지의 세심한한다. 조심스럽게 무소속 바늘 끝가있다 그러한 이상의 주사기를 켜십시오. emulsifying 바늘이 측면에 다른 주사기를 첨부하십시오. cercariae를 변환하기 위해서 주사 바늘을 통해 40 회 (앞뒤로 20 회)의 총 혼합물을 전달합니다. 혼합물이 아래의 주사기에 포함되어 상단 주사기가 비어 있는지 세로로 같은 주사기를 놓습니다. 최고 주사기를 제거하고 70 % 에탄올로 소독. 깨끗한 높은 벽으로 둘러싸인 100mm X 50mm pyrex 요리 또는 crystallizing 그릇에 드롭하여 보증금 혼합 놓습니다. 70 % 에탄올에 바늘과 주사기를 소독. 37 ° C RPMI 1640 전체 미디어와 같은 추가되는Luria의 국물 플레이트를 따르고처럼 배양 접시의 바닥이 완전히 덮여 있습니다. 페트리 접시의 중앙에 schistosomules를 수집하는 부드럽게 소용돌이. 물 튀기지 마십시오. 참고 : 더 적절하게 중앙에 schistosomules을 시각화하기 위해이 단계에 대한 후드 라이트를 해제하는 것이 유용할 수 있습니다. 즉시 멸균 스포이트를 사용하여 잘 신선한 12 웰 세포 배양 플레이트에 집중 schistosomules를 입금. schistosomules 더 이상 접시 (약 10 배)의 중심에 존재하지 않습니다 때까지 2.9와 2.10를 반복합니다. 신선한 잘 각 후속 컬렉션을 입금. 물론 최대 중간 (~ 1.5 ML) prewarmed RPMI 전체 미디어 각각 입력합니다. schistosomules 및 cercariae 부재의 존재를 확인하기 위해 거꾸로 현미경을 시각화. 성장 CO 2 배양기에서 schistosomules 37으로 설정되어 ° C와 5% CO 2. 3. 대표 결과 : 문화 미디어로 변모 schistosomules의 보류중인 전송, 거꾸로 밝은 – 필드 현미경 (예를 들어, 장비 표 참조) 아래의 시각화는 변형 schistosomules가 우물에 존재하는 1, 그림과 비슷한 이미지를 얻을 수 있습니다. 잠재적인 오염 물질은 그대로 cercariae, 절단 cercarial 꼬리, 또는 기타 이물질을 포함 수 있습니다. 더 거꾸로 현미경을 사용할 수 없다면, 표준 현미경 또는 해부 범위는 schistosomules을 시각화하기에 충분합니다. 이 절차는 항상 cercariae의 100 %를 변환하지 않습니다. 그림 1 : 변환 Schistosomulum 그림 2 : Cercariae 및 잘린 꼬리