Trasformazione e cercarie In vitro La coltivazione di Schistosoma mansoni Schistosomules

Misure di sicurezza: Cercarie schistosoma può direttamente penetrare la pelle senza la necessità di un taglio o pori, e causare la schistosomiasi cronica. S. mansoni è un livello di biosicurezza 2 organismo, quindi un equipaggiamento di protezione individuale e le misure di sicurezza adeguate devono essere seguite quando si lavora con Cercaire infettive. La maggior parte delle attrezzature necessarie per crescere e trasformare schistosomi è standard, con poche eccezioni chiave indicato nella tabella alla fine del protocollo. Tutti i lavori cercarie dovrebbe essere fatto in una stanza isolata. Schistosomules dovrebbe essere colta in una sterile, cappuccio approvato biosicurezza. Due strati di nitrile o guanti di lattice dovrebbero essere indossati, così come un camice, un paio di scarpe impermeabili, pantaloni senza buchi o strappi, e protettori manica impermeabile all'acqua per i polsi e le braccia. In caso di sversamento accidentale, spruzzare immediatamente l'area contaminata con etanolo al 70% o 10% di candeggina, strofinando vigorosamente se sulla vostra persona. Questo sarà sufficiente per disabilitare il parassita, ma ogni eventuale infezione devono essere segnalati e presi sul serio. Anche se non sono congenitamente schistosomules infettive, le linee guida istituzionali variano, e dovrebbe essere consultato per determinare se BSL2 precauzioni sono necessarie durante le fasi della vita non infettive. Disinfettare tutte le superfici che vengono a contatto con sostanze potenzialmente infettivi dopo l'esperimento viene eseguito e gettare rifiuti in un contenitore approvato rischio biologico. NOTA: Copertina cassonetti ospitare lumaca 1 a 2 giorni prima del distacco e proteggere dalla luce 1. La raccolta cercarie dall'host lumaca Riempire un ambiente pulito, coppa 500mL circolazione dei detergenti a metà pieno di acqua distillata equilibrati a temperatura ambiente. Se si lavora con le lumache host infetto con miracidi in date diverse, utilizzare un bicchiere separato per ogni data di infezione (Questo è particolarmente importante se le lumache saranno riutilizzati per futuri esperimenti). La dimensione del bicchiere può anche essere più piccolo a seconda della esperienza dell'utente. Raccogliere gli host infetti lumaca che si desidera versare e accuratamente depositarli nel bicchiere con un pesce d'acquario standard di rete e pinze uso generale, se necessario. Bicchiere posto su un vassoio d'emergenza versare circa 8 a 12 pollici sotto una lampada a incandescenza. Lasciate riposare per 1-2 ore sotto la luce. Cercarie uscire l'host lumaca quando esposto alla luce. Con attenzione filtrare lumache dalla miscela cercarie. Prendere misure di sicurezza supplementari, come miscela altamente contagiosa. Ricorda, cercarie possono direttamente penetrare la pelle umana! Sostituire mischia fonte di luce per circa 15 minuti, consentendo ad ogni questione rifiuti particelle di stabilirsi. Trasferimento cercarie in un beuta pulita utilizzando una pipetta, evitando i detriti sul fondo del bicchiere. Porre il pallone a circa 45 ° su ghiaccio al buio per 45 – 60 minuti, permettendo cercarie di stabilirsi in un angolo. Utilizzare una pipetta 50 ml di togliere 75 al 90% del supernatante e depositarlo in un bicchiere contenente candeggina al 10% o 70% di etanolo, facendo attenzione a non lasciare che le gocce d'acqua che contiene a goccia cercarie dalla pipetta. Agitare la beuta contenente cercarie delicatamente per risospendere le cercarie in soluzione. Utilizzare una pipetta per trasferire il campione al sterile 50 ml provette coniche. Posizionare i tubi di nuovo sul ghiaccio per 20 minuti al buio. Cercarie si depositerà verso il fondo della provetta al buio. 2. Trasformazione manuale di cercarie di schistosomules Prima di iniziare: Fare RPMI 1640 completo (RPMI, 5% siero fetale bovino, 1X Pen / Strep) e calda a 37 ° C. (E 'fondamentale che il siero fetale bovino utilizzato è stato inattivato tramite incubazione a 56 ° C per 1 ora come schistosomi possono essere sensibili a complemento). In una cappa di rischio biologico, rimuovere il surnatante fino a 5 a 10 ml di soluzione in ogni 50 ml con una pipetta o un dispositivo vuoto. Collegare un AWG 22 double-ended, luer lok emulsionare l'ago di una siringa di dimensioni appropriate. Lentamente disegnare impasto nella siringa. Raccogliere cercarie da tutte le provette da 50 ml in una siringa. Essere attenti di gocciolamento. Con attenzione volta siringa sopra tale che l'estremità ago separato è in alto. Allegare un altro siringa a questa parte dell'ago emulsionante. Passare la miscela attraverso l'ago per un totale di 40 volte (20 volte avanti e indietro) per trasformare le cercarie. Posizionare le siringhe verticalmente in modo tale che la miscela è contenuta nella siringa in basso e in alto la siringa è vuota. Rimuovere la siringa superiore e disinfettare in etanolo al 70%. Deposito goccia a goccia miscela in un ambiente pulito ad alta parete 100 millimetri x 50 millimetri piatto pirex o un piatto cristallizzazione. Disinfettare di aghi e siringhe in etanolo al 70%. Aggiungi 37 ° C RPMI 1640 completo dei media in modo che ilparte inferiore della scatola di Petri è completamente coperto, come se versando un piatto di brodo Luria. Agitare delicatamente per raccogliere schistosomules al centro della scatola di Petri. Evitare gli schizzi. Nota: Può essere utile per spegnere la luce cappa per questa fase di visualizzare in modo più adeguato la schistosomules al centro. Immediatamente deposito schistosomules concentrata in un nuovo 12-pozzetti di coltura cellulare e con un contagocce sterile. Ripetere 2.9 e 2.10 fino schistosomules non sono più presenti nel centro del piatto (circa 10 volte). Deposito ogni successiva raccolta in un pozzo fresco. Riempire ogni bene fino a metà corsa (~ 1,5 ml) con i media preriscaldata RPMI completo. Visualizzare su un microscopio invertito per verificare la presenza di schistosomules e assenza di cercarie. Crescere il schistosomules in un incubatore CO 2 set a 37 ° C e 5% di CO 2. 3. Rappresentante dei risultati: In attesa di trasferimento schistosomules trasformato in terreni di coltura, la visualizzazione sotto una rovesciata luminoso microscopio a campo (vedere la tabella attrezzature per un esempio) dovrebbe produrre una immagine simile alla figura 1, in cui solo schistosomules trasformato sono presenti nel pozzo. Potenziali contaminanti potrebbero includere cercarie intatta, code mozzate cercarie, o altri residui. Se non microscopio invertito è disponibile, un microscopio standard e persino un campo di applicazione dissezione sarà sufficiente visualizzare la schistosomules. Si noti che questa procedura non sempre trasformare il 100% delle cercarie. Figura 1: Schistosomulum Trasformato Figura 2: Cercariae e Tails Severed