بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules
Summary
نحن تصف<em> في المختبر</em> طريقة لزراعة schistosomula من الطفيليات دودة مسطحة<em> البلهارسيا المنسونية</em> ، عن طريق التحول من الحصاد وcercariae معدية من حلزون المياه العذبة وسيطة ذات السرتين الجرداء المضيف.
Abstract
طفيليات البلهارسيا هي العوامل المسببة للمرض البلهارسيا ، وهو مرض مزمن يؤثر على المنهكة أكثر من 200 مليون شخص حول العالم ويحتل المرتبة الثانية بعد الملاريا من بين الأمراض الطفيلية في مجال الصحة العامة وآثار اجتماعية واقتصادية (1-4). طفيليات البلهارسيا والديدان مثقوبة مع دورة حياة معقدة تتبادل بين الحياة الطفيلية في الثدييات والرخويات المضيفين مع التدخل السباحة الحرة مراحل. لفترة وجيزة ، حرر السباحة cercariae تصيب مجموعة الثدييات عن طريق اختراق الجلد مع المعونة من البروتياز يفرز ، خلال الوقت الذي تفقد cercariae ذيولها ، تتحول schistosomules. يجب أن تهرب الآن schistosomules النظام المضيف المناعي ، ووضع القناة الهضمية للهضم من خلايا الدم الحمراء ، وعلى الرغم من أن ترحيل الرئتين والدورة الدموية بوابة طريقها إلى وجهتها النهائية في الكبد ونظام البوابة في نهاية المطاف الأوردة المساريقي (لS. المنسونية) حيث الذكور والإناث والديدان لم الزوج ، وتنتج مئات من البيض يوميا. تفرز بعض البيض من الجسم في المياه العذبة ، حيث يفقس البيض في السباحة الحرة miracidia (5-10). وتصيب أنواع القواقع miracidia محددة وتحويلها الى sporocysts الأم وابنتها ، والتي بدورها ، تنتج cercariae المعدية ، واستكمال دورة الحياة. للأسف ، لا يمكن كامل دورة حياة البلهارسيا يمكن تربيتها في المختبر ، ولكن يمكن أن تتحول إلى عدوى cercariae schistosomules ، ويمكن تربيتها في schistosomules لأسابيع لتحليل التنمية البلهارسيا في المختبر أو تحليل ميكروأري. في هذا البروتوكول ، ونحن نقدم وصفا للتحول بالمذنبات البصرية واستزراع schistosomules المختبر. تسلط علينا من cercariae المعدية ذات السرتين الجرداء الحلزون المضيف وتحويل يدويا لهم في فصل schistosomules التي ذيولها باستخدام الاستحلاب المزدوج انتهت الإبرة. وصف التحول في المختبر بالمذنبات وتقنيات الثقافة schistosomules تجنب استخدام مجموعة الثدييات ، والذي يبسط التصور من البلهارسيا ويسهل جمع الطفيلي للتحليل تجريبي. التحول في المختبر وتقنيات زراعة من البلهارسيا وقد تم القيام به لسنوات (11 ، 12) ، ولكن لم توضع بروتوكولات البصرية التي تتوافر للمجتمع الدولي بأسره.
Protocol
Discussion
يمكن أن تنشأ عدة مشاكل محتملة أثناء إجراء التحويل ، إلا أن هذا البروتوكول يهدف إلى تفادي معظم هذه المشاكل. أحد الأخطار المحتملة هو انسداد الإبرة الاستحلاب ، والذي ينشأ عادة بسبب الحطام التي خلفها الحصاد في الخطوة 1.3. تأكد من السماح لجميع الجسيمات ليستقر في الخطوة 1.5 و لنقل cercariae بعناية في الخطوة 1.6 لتجنب هذه المشكلة. أيضا ، كما هو موضح من قبل ، والعمل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، واستخدام معدات الحماية الشخصية (حتى دروع لحماية الوجه) ، وتجنب الضغط الزائد على المحاقن مستحسنة.
يمكن فصل بالمذنبات ذيول يمكن تصور في وسائل الإعلام ، مما يدل على الفقراء خلال فصل الخطوة 2.9. ذيول يحمل اقتراحا مثل تشنج ولها شكل متميز (انظر الشكل 2) ، ويتم تمييزها بسهولة thusly من schistosomules. يمكن إزالة ذيول بواسطة غسل schistosomules تتجاوز RPMI كاملة schistosomules السماح لتسوية. وسوف تظل عائمة ذيول ويمكن إيقاف بالمكنسة الكهربائية.
إذا cercariae سليمة موجودة في وسائل الإعلام ، لم ينفذ هذا التحول في الخطوة 2.5 بشكل صحيح. ويصور مشهدا لالمذنبات سليمة في الشكل 3B كمرجع. إذا كانت هذه المشكلة ، التأكد من أن الإبرة الاستحلاب المستخدمة هي من الحجم المناسب. أيضا ، يمكن زيادة عدد المرات التي يتم تمريرها من خلال خليط بالمذنبات الإبرة ، على الرغم من 40 مرة هو عادة أكثر بكثير مما يكفي لتقترب من 100 ٪ من قص ذيول بالمذنبات.
وكان أول وصف التحول من المذنبات في schistosomules في عام 1974 وWikel كولي (13). منذ ذلك الحين ، أنجز إعداد schistosomules باستخدام استراتيجية القص مع الإبر والمحاقن على النحو المبين في هذا البروتوكول ، أو باستخدام نهج vortexing والمنفصلين مع تدرجات لpercoll (14 ، 15) أو تحريكها كما هو موضح في هذه الورقة. موصوفة بجمال هذه التقنيات اثنين من أجل التحضير لويس schistosomules فريد (16) ولمزيد من المعلومات عن زراعة مزيد من schistosomules للنمو على المدى الطويل يمكن العثور عليها في مركز الموارد البلهارسيا المعدية ( www.schisto – resource.org ).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل ريزيرف الأموال الغربية التي قدمت إلى جامعة بدء التشغيل E. جولي. وقدمت القواقع المصابة من قبل مركز المعلومات البلهارسيا ، NIH – المعدية (NIAID العقد رقم HHSN272201000009I). كما نشكر جلالة الملك وكريس رونالد بلانتون للحصول على الدعم في تأمين القواقع المصابة والبلهارسيا لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 22g x 2-7/8″ Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G |
| RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 |
| Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D |
| General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C |
| Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |
References
- Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. Schistosomiasis. N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).
- Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).
- Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis. Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).
- King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis. Lancet. 365, 1561-159 (2005).
- Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology. 124, 153-167 (2002).
- Grabe, K., Haas, W. Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration. Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).
- Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni. J Parasitol. 58, 476-480 (1972).
- Saladin, K. S. Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes. J Parasitol. 68, 120-124 (1982).
- Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum. Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).
- Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes. PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing. J Parasitol. 67, 179-185 (1981).
- Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J Parasitol. 81, 714-722 (1995).
- Colley, D. G., Wikel, S. K. Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules. Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).
- Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll. Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).
- Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules. Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).
