טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

אמצעי בטיחות: Cercariae Schistosome יכול לחדור את העור ישירות ללא לצרכים של חתך או נקבוביות, ולגרום schistosomiasis מחלה כרונית. S. mansoni הוא 2 רמת biosafety האורגניזם, ולכן מתאים ציוד מגן אישי ואמצעי בטיחות נאותה חייב להיות אחריו כאשר עובדים עם cercaria זיהומיות. רוב הציוד הדרוש לגדול ולהפוך schistosomes הוא רגיל, עם כמה יוצאים מן הכלל מפתח ציין בטבלה בסוף הפרוטוקול. כל עבודה cercarial צריך להיעשות בחדר מבודד. Schistosomules צריך להיות תרבותי ברדס סטרילי, biosafety אושרה. שתי שכבות של כפפות גומי או nitrile יש ללבוש, כמו חלוק מעבדה, זוג עמיד למים של נעליים, מכנסיים, ללא חורים או דמעות, מגיני שרוול אטום על פרק כף היד והזרועות צריכים. במקרה של דליפת מקרי, מיד לרסס שטח מזוהם עם אתנול 70% או 10% אקונומיקה, שפשוף נמרץ אם על האדם שלך. זה יהיה מספיק כדי לנטרל את הטפיל, אבל כל זיהום אפשרי צריך להיות מדווחים ברצינות. למרות schistosomules אינם מולד זיהומיות, הנחיות מוסדיים להשתנות, יש להתייעץ עם כדי לקבוע אם BSL2 אמצעי זהירות נדרשים בשלבי החיים noninfectious. לחטא את כל המשטחים אשר באים במגע עם כל חומר זיהומיות פוטנציאלי לאחר הניסוי מתבצע ולסלק פסולת במיכל Biohazard אושרה. הערה: חילזון כיסוי מארח פחי 1-2 ימים לפני שפיכת ולהגן מפני אור 1. מסיק cercariae מהמחשב המארח חילזון ממלאים כוס נקייה, 500ml ללא דטרגנטים מלא באמצע עם מים מזוקקים equilibrated לטמפרטורת החדר. אם עובדים עם חלזונות מארח נגוע miracidia בתאריכים שונים, השתמש כוס נפרדת עבור כל תאריך זיהום (הדבר חשוב במיוחד אם חלזונות יהיה לעשות בה שימוש חוזר עבור ניסויים בעתיד). גודל הכוס יכול גם להיות קטן בהתאם החוויה של המשתמש. איסוף המארחים חילזון נגוע אתה רוצה לשפוך בזהירות להפקיד אותם בכוס באמצעות הדגים באקווריום סטנדרטי נטו מלקחיים למטרות כלליות לפי הצורך. כוס מניחים על מגש לשפוך חירום כ 8-12 ס"מ מתחת למקור ליבון קל. בואו לעמוד על 1-2 שעות תחת האור. Cercariae יציאה המארח חילזון בעת ​​חשיפה לאור בהיר. בזהירות לסנן חלזונות מתערובת cercariae. קח אמצעי בטיחות נוספים, כמו תערובת היא מדבקת מאוד. זכור, cercariae יכולים לחדור ישירות לעור אנושי! החלף תערובת תחת מקור אור למשך כ 15 דקות, מה שמאפשר לכל עניין פסולת החלקיקים להתיישב. העברת cercariae לתוך בקבוק Erlenmeyer נקי באמצעות pipet, הימנעות פסולת בתחתית הכוס. מניחים את הבקבוק על כ זווית של ° 45 על הקרח בחושך במשך 45-60 דקות, המאפשר cercariae להתיישב לפינה אחת. השתמש pipet 50 מ"ל להסיר 75-90% מכלל supernatant לבין הפקדת אותה כוס אקונומיקה המכיל 10% או 70% אתנול, נזהרת שלא לתת טיפות מים המכילים לטפטף cercariae מ pipet. מערבולת את הבקבוק המכיל Erlenmeyer cercariae בעדינות resuspend cercariae בתמיסה. השתמש pipet להעביר את המדגם ל -50 מ"ל סטרילי צינורות חרוטי. המקום צינורות שוב על קרח למשך 20 דקות בחושך. Cercariae יישב כלפי התחתון של הצינור בחושך. 2. שינוי ידני של cercariae כדי schistosomules לפני שתתחיל: ודא RPMI 1640 מלאה (RPMI, 5% בסרום שור עוברית, 1X פן / סטרפטוקוקוס) וחם על 37 ° C. (זה חיוני כי בסרום שור העובר בשימוש כבר מומת על ידי דגירה של 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כמו schistosomes יכולים להיות רגישים כדי להשלים). במנדף Biohazard, להסיר supernatant עד 5 מ"ל עד 10 מתוך פתרון בכל חרוטי 50 מ"ל באמצעות pipettor או מכשיר ואקום. צרף מד 22 פעמיים הסתיים, luer Lok emulsifying המחט במזרק בגודל מתאים. לאט לאט לשאוב תערובת לתוך המזרק. איסוף cercariae מכל 50 צינורות מ"ל מזרק. היו קשובים שומן. בזהירות להפוך מזרק על כך שסוף מחט פנויות תלוי. צרף עוד המזרק בצד הזה של המחט emulsifying. לעבור את התערובת דרך המחט בסך הכל 40 פעמים (20 פעמים הלוך ושוב) להפוך את cercariae. מקמו את במאונך כגון מזרקים כי תערובת הכלול מזרק התחתונה את המזרק העליון ריק. הסר את המזרק העליון לחטא ב 70% אתנול. תערובת הפקדה טיפה אחר טיפה לתוך נקי גבוה צלחת חומה 100mm x 50mm פיירקס או צלחת גיבוש. לחטא מחט המזרק אתנול 70%. הוסף 37 ° C 1640 RPMI התקשורת להשלים כזהתחתית הצלחת פטרי מכוסה לחלוטין, כאילו שופך צלחת מרק לוריא. מערבולת בעדינות כדי לאסוף schistosomules במרכז צלחת פטרי. הימנע התזה. הערה: זה יכול להיות שימושי כדי לכבות את האור מכסה המנוע של שלב זה בצורה נכונה יותר לדמיין את schistosomules במרכז. מיד להפקיד schistosomules מרוכז לתוך צלחת תא טרי 12 גם בתרבות גם באמצעות טפטפת סטרילית. חזור על 2.9 ו – 2.10 עד schistosomules אינם מציגים במרכז צלחת (כ 10 פעמים). הפקדה כל אוסף הבאים בבאר טריים. מלא כל טוב באמצע הדרך (~ 1.5 מ"ל) עם prewarmed התקשורת RPMI להשלים. דמיינו על מיקרוסקופ הפוך לאמת את הנוכחות של schistosomules והיעדר cercariae. לגדל את schistosomules ב CO 2 באינקובטור מוגדר 37 ° C ו 5% CO 2. 3. נציג תוצאות: העברת בהמתנה של schistosomules הופכת התקשורת לתרבות, ויזואליזציה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוכה (ראו טבלה ציוד למשל) אמור להניב תמונה דומה באיור 1, שבו רק schistosomules הפך נמצאים הבאר. מזהמים פוטנציאליים יכול לכלול cercariae שלם, זנבות cercarial ניתק, או פסולת אחרת. אם לא מיקרוסקופ הפוכה זמין, מיקרוסקופ רגיל או אפילו היקף דיסקציה יהיה מספיק כדי להמחיש את schistosomules. שים לב כי נוהל זה אינו תמיד להפוך 100% cercariae. איור 1: Schistosomulum שינו איור 2: Cercariae וזנבות הכרות