خفض التحميل : أداة مفيدة لفحص مدى تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية توصيلات الراسم الشبكية
Summary
ووصف طريقة سهلة ومريحة لتحديد مدى اقتران تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية في شبكية العين الكاشفة. هذه التقنية تمكن واحد لتحقيق وظيفة نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية الكهربائية في الشبكية سليمة في ظل ظروف إضاءة مختلفة وفي أوقات مختلفة من النهار والليل.
Abstract
بالإضافة إلى انتقال متشابك الكيميائية ، يمكن أن الخلايا العصبية التي ترتبط بها تقاطعات الفجوة التواصل بسرعة أيضا عن طريق نقل متشابك الكهربائية. أدلة متزايدة تشير إلى أن الفجوة لا تقاطعات تصريح تدفق التيار الكهربائي والنشاط متزامن بين الخلايا المترابطة أو إضافة ، إلا أن قوة أو فعالية الاتصالات بين الخلايا الكهربائية مقرونة يمكن التضمين إلى 1،2 حد كبير. بالإضافة إلى ذلك ، وكبيرة قطرها الداخلي (~ 1،2 نانومتر) من العديد من القنوات تقاطع الفجوة التصاريح ليس فقط تدفق التيار الكهربائي ، ولكن أيضا انتشار الخلايا جزيئات صغيرة إشارات والأيضات بين الخلايا مترابطة ، بحيث تقاطعات الفجوة قد توسط أيضا الأيض الاتصالات والكيميائية . ويمكن دراسة مدى قوة الاتصالات بين الخلايا العصبية الفجوة صلي والتشكيل من خلال الموصلات العصبية وغيرها من العوامل التي كتبها في وقت واحد تسجيل كهربائيا من الخلايا وإلى جانب تحديد رانه مدى انتشار جزيئات التتبع ، والتي هي قابلة للاختراق تقاطع الفجوة ، ولكن ليس نفاذية الغشاء ، وبعد حقن الخلايا في iontophoretic واحد. ومع ذلك ، يمكن لهذه الإجراءات سيكون من الصعب للغاية القيام على الخلايا العصبية مع somata صغيرة في الأنسجة العصبية سليمة.
وقد أجريت دراسات عديدة حول المشابك الكهربائية والتشكيل من الاتصالات الكهربائية في شبكية الفقاريات ، حيث تم توصيل بالكهرباء كل من الخلايا العصبية للشبكية خمسة أنواع من قبل تقاطعات الفجوة 3،4. وقد أظهرت أدلة متزايدة على أن الإيقاعية (24 ساعة) على مدار الساعة في الشبكية والتغييرات في ضوء التحفيز تنظيم تقاطع الفجوة اقتران 3-8. على سبيل المثال ، أظهرت مؤخرا أن العمل على مدار الساعة الإيقاعية الشبكية يقلل الفجوة بين مفترق طرق توصيل قضيب وخلايا مستقبلة للضوء مخروط خلال النهار عن طريق زيادة الدوبامين تنشيط مستقبلات D2 ، ويزيد بشكل كبير قضيب مخروط اقتران ليلا عن طريق الحد من تفعيل مستقبلات D2 <suف> 7،8. ومع ذلك ، لا يقتصر على هذه الدراسات من الصعب للغاية تنفيذها على الخلايا العصبية مع somata صغيرة في الأنسجة العصبية للشبكية سليمة ، ولكن يمكن أن يكون من الصعب السيطرة عليها على نحو كاف ظروف الإضاءة أثناء الدراسة الكهربية من الخلايا العصبية للشبكية واحدة لتجنب الضوء الناجم عن التغيرات في مفترق الفجوة تصرف.
هنا ، نقدم طريقة بسيطة لتحديد مدى اقتران تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية في شبكية العين الكاشفة في ظل ظروف إضاءة مختلفة وفي أوقات مختلفة من النهار والليل. هذه التقنية خفض التحميل هو تعديل لتحميل كشط 9-12 ، الذي يقوم على تحميل صباغة ونشرها من خلال فتح قنوات تقاطع الفجوة. تحميل كشط يعمل بشكل جيد في الخلايا المستزرعة ، ولكن ليس في شرائح سميكة مثل شبكية العين سليمة. وقد استخدمت هذه التقنية خفض التحميل لدراسة اقتران مبصرة في الأسماك سليمة وشبكية العين الثدييات 7 ، 8،13 ، ويمكن استخدامها لدراسة تقارن بينالخلايا العصبية للشبكية أخرى ، كما هو موضح هنا.
Protocol
Discussion
طريقة قص صفها التحميل هنا هو تقنية مفيدة وصريحة لتحديد مدى اقتران تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية في شبكية العين الكاشفة في ظل ظروف إضاءة مختلفة وفي أوقات مختلفة من النهار والليل. مزايا هذه التقنية تشمل القدرة على قياس مدى تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية اقتران التتبع في أنسجة الشبكية سليمة في ظل مجموعة متنوعة من ظروف الإضاءة خلال النهار والليل والقيام بذلك عن جانب الخلايا العصبية التي somata صغيرة القطر. القيود المفروضة على هذه التقنية في دراسة تقاطعات الفجوة في خريف أنسجة سليمة إلى فئتين عامتين. أولا ، قد نشر من خلال التتبع تقاطعات الفجوة المفتوحة من الصعب نسبيا لمراقبة نظرا لقطرها) صغير من التهمة أو المرتبطة مع القنوات المفتوحة وب) 1،14،15 الكميات النسبية للمقصورات الخلوية بالإضافة. وهذا هو ، نشر التتبع من خلية صغيرة إلى أكبر خلية أو مجموعة من الخلايا مقرونة ، شركاتحمراء مكتوب لنشر التتبع من أكبر أصغر خلية إلى خلية ، قد يكون أكثر صعوبة للكشف بسبب تخفيف التتبع. ثانيا ، في ظل بعض الظروف الفسيولوجية ، قد حد من الانتشار من خلال التتبع تقاطعات الفجوة في أنسجة سليمة لا تعكس بدقة قوة تصرف الفجوة صلي بسبب الاختلافات في تصرف الأيونات الصغيرة التي تحمل الكهربائية الحالية ، مقارنة مع نفاذية التتبع كبيرة نسبيا جزيئات 1،14،15. بشكل عام ، دليل على اقتران التتبع يشير بقوة إلى وجود وأداء فتح قنوات تقاطع الفجوة ، ولكن تحت بعض الشروط الفسيولوجية ، والتتبع نشرها أو قد لا يحدث لاحظ أن على الرغم من التسجيلات الكهربية توحي وجود وأداء تقاطعات الفجوة المفتوحة.
يبدو من المرجح أنه يمكن أيضا خفض تقنية التحميل يمكن استخدامها لتحقيق في مدى اقتران التتبع تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية في أنسجة سليمة من مناطق أخرى من أنظمة العصبي المركزيTEM.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح المجلس الاعلى للقضاة وEY005102 لEY018640 إلى CPR
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | NIH | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab Corp. |
References
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A. Electrical synapses in the mammalian brain. Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O’Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O’Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O’Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
