インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

1。コロニーアッセイのために馴化培地（CM）を生成するためにin vitroでの膵臓細胞様細胞へのマウスES細胞の分化さらなる差別化のためのマウスES細胞の維持、懸濁培養における胚様体（EB）の形成、および添付ファイルの文化のための手順は、以前は次の1から3に記載し、本報告書の焦点ではありませんされています。私たちの差別化プロトコルに関連する手順の概略プレゼンテーションを図1に示されています。 高品質の馴化培地を得るためには、それは最初にそれらの少なくとも30から40パーセントが少なくとも150μmの直径とされる6日齢のEBSを生成することが重要です。大きいEBは、分化促進を（図2）を示唆し、光学顕微鏡下で黒い斑点が含まれている必要があります。高品質の牛胎児血清（FCS）の選択は、そのようなEBSを生成することが重要です。高品質のFCSのロットはdifferentiatをサポートする能力に基づいて選択されていますインスリン1に向かってEBのイオン、グルカゴンおよびRT – PCR解析によって検出された後の段階（日18-20）におけるアミラーゼの2Aの遺伝子発現。それは静かに井戸の中心に一日 – 6 EBSを収集するためにプレートを回転させることが重要です – また、一日- 6 EBを懸濁培養からの添付ファイルの文化（6ウェルプレートのウェルあたり100 EBは約80）に転送されています。その後のアタッチメント培養段階におけるEBから膵臓細胞様細胞のよりよい発達の細胞間接触の結果を向上させる理由は不明、操縦のための。 文化の日の13日に、新鮮なアタッチメント文化とアタッチメントの培養培地（DMEM/F-12（1:1）、15％ノックアウト血清代替物、2 mMのL -グルタミン、50 U / mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン）を交換メディアcontaining10 mMのニコチンアミド、0.1 nMのエキセンディン-4、および10 ng / mLのヒト組換えアクチビンSSB（すべての濃度は、最終的なもの）。 文化の日の16日に、ステップ1.1からメディアを収集し、0.2μmのポリエーテルを介してフィルタulfone膜。この時点から収集されたメディアは、馴化培地（CM）と呼ぶことにする。一定分量は、15 mLのファルコンチューブにCMと-80に保存° Cになるまで（下記のセクション3を参照）、半固体培養の直前に。 2。蛍光活性化セルソーターを用いて、単一の細胞懸濁液中の前駆細胞膵臓のような入手方法前述のようにEGFPレポーター遺伝子は、Ngn3座の1つの対立遺伝子を置き換えたNgn3 – EGFP、として指定されたノックインマウスES細胞株、4は区別された2 Ngn3は、転写因子を含む塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）です。開発時の膵内分泌前駆細胞によって発現文化通常差別Ngn3 – EGFP +とNgn3 – EGFPを取得するためにソートされた5 – 16はデイ- 。。細胞は1,2 単一の細胞懸濁液に分化した細胞の解離。 日 – 16文化WIインキュベート番目の0.25％トリプシン- EDTA（3分、37℃）は培養ウェルから細胞を取り除くために。 トリプシン活性を停止するために10％FCSを追加。 マグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、および5分間、300 xgで遠心分離で細胞を洗浄する。 上清を除去し、単一の細胞懸濁液を生成するには、4 mg / mLのコラゲナーゼBと2000 U / mLのデオキシリボヌクレアーゼ（DNase処理）I（30分、37℃）で細胞塊を培養する。細胞ペレットの解離のプロセスを早めるために10分ごとを混乱させるための1000μLピペットを使用してください。 PBSを含む0.1％BSAで細胞を洗浄し、5分間300 × gで遠心。 上清を除去し、0.1％BSAを含むPBSで細胞を懸濁します。 ソートのための細胞の調製。 ソート中に細胞の再凝集を防止するためにあらゆるmLの細胞懸濁液を2μLのDNase Iを（1 MU / mL）を追加。 40から70ミクロンmを介して単一の細胞懸濁液を渡す大細胞凝集物を除去するESH。 単一の細胞懸濁液にDAPIを（1μg/ mlの最終濃度）を追加します。 セルソーターで、フローサイトメトリーのデータを取得する。 MoFlo MLS（ベックマンコールター）セルソーターは、このレポートのために使用されていました。 ソートのための細胞集団のゲー。 Ngn3 – EGFP +とNgn3 – EGFP -細胞は前方散乱対側方散乱を持つ最初のゲートです（図3A）、DAPI対側方散乱（図3B）、パルス幅対側方散乱（図3C）が続き、最終的にFL1対自家蛍光（図3D）。 Ngn3 – EGFPの汚染を制限するために-ソート中の細胞、Ngn3 – EGFP +細胞の最終的なソートのゲートは、意図的に右（矢印の図3E）に移動です。 Ngn3 – EGFP ESラインまたは同じ舞台、日 – 16文化などTL1のES細胞（図3D、左のパネル）などの非トランスジェニックライン、から、使用することができるから陰性コントロールのゲーティングのため、いずれの日- 6 EBの。 ソートNgn3 – EGFP +とNgn3 – EGFP <suP> -細胞。 3。半固体培養へのメッキソートされた細胞マトリゲルの準備。 1チューブあたりのmL及び使用前に-20℃で保存のアリコートマトリゲル。 冷凍のアリコートを、使用直前に解凍して3時間℃で一晩または氷上で4で配置する必要があります。融解したアリコートは、再凝固を避けるために、半固体培養の準備中に氷の上に残る必要があります。 メチルセルロース溶液（3.3％）の準備。 メチルセルロースの粉末をオートクレーブすることができます。無菌メチルセルロース溶液を得るために、準備処理中にきれいな秤量ボートやオートクレーブ、攪拌棒、ビーカー、フラスコ、その他のハードウェアを使用してください。 メチルセルロース溶液の調製の前にある日、4での滅菌再蒸留水の店舗を200mL℃にまた、100 U / mlペニシリンを含む2倍DMEM/F12培地（粉末DMEM /二重蒸留水でF – 12を溶解することにより準備）500 mlを調製し、4で100μg/ mlのストレプトマイシン及び店舗℃のメチルセルロースの準備の日に、上にアルミホイルの切れ端で1000mlのガラスビーカーに滅菌蒸留水500 mLを加える。気泡の水を取り除くために、少なくとも30分間沸騰させます。 2000mlのガラス製フラスコに大型攪拌棒（長さが少なくとも3インチ）を置きます。 沸騰したお湯300mlを測定し、フラスコに移す。 攪拌プレート（加熱なし）でフラスコを置きます。徐々に気泡を生成しないようにお湯をかき混ぜる。 メチルセルロースの粉末33グラムの重さと非常にゆっくりとお湯に追加します。お湯は、効率的にメチルセルロースの粉末を濡らすと冷たい温度で、その後の溶解を補助するために必要です。 温度が約40から45になるまで粉体を攪拌し続ける℃まで冷却メチルセルロースの混合物に200mLの冷滅菌蒸留水を加えます。直後に後、このソリューションは、そのメチルセルロースを水相に溶解されていることを示す、透明で粘性をオン見て開始する必要があります。ソリューションを実現するために手の渦フラスコを完全に混合される。 500 mLの冷倍DMEM/F12メディアを追加します。ミックスに手で旋回し続ける。 寒い部屋で撹拌プレート上フラスコを置き、ゆっくりと24〜48時間メチルセルロース溶液をかき混ぜる。 分注し-20℃で保存ボトルあたり125mLのに解決策、および店舗の試料は滅菌ペトリ皿に分注し、37に配置する必要があります℃のインキュベーターでは、無菌性をテストする。融解メチルセルロース溶液は、最大2ヶ月まで冷蔵庫に保管することができます。 馴化培地の準備。 使用直前に融解CM（セクション1参照）。半固体培養の準備を通して氷上にCMをしてください。 1.0 Mニコチンアミド、0.1μMエキセンディン-4、10μg/ mLの組換えヒトアクチビンβB、および10 A＆M：以下の成長因子を準備U; g / mlのVEGF – A。 -20℃とアクチビンβBとVEGF – -80℃の時ニコチンアミドおよびエキセンディン-4に格納し、使用直前にそれらを解凍。すべての半固形培地の成分は、メッキ中に氷上で保存する。それは後にコロニー形成のために必要が発見された- VEGFの加えていることに留意すべきである2。 ウシ胎児血清の準備。 FCSは、使用前に不活化熱する必要があります。 56℃30分間FCSをインキュベート℃の補体タンパク質を不活性化するために水浴インチ初期FCSストックボトルは、500以上のmLをそれ125mLのバイアルにを保持している場合は。増加した表面積は、ボリューム全体の偶数と徹底した加熱が保証されます。ボトルは、-20℃で保存する前に、少なくとも1時間、室温で冷却してください解凍したFCSが0.2μmの使用前に濾過される。 ソートされた細胞の培養成分を混ぜる。 の凝固を防ぐために常に準備中に氷の上のセルとすべての半固形培地成分を保持するマトリゲル。を含むマトリゲルに接するすべての電源は、ピペットチップ、シリンジと針は、寒いはずです。使用前に-20℃少なくとも30分でこれらの電源を置きます。 24ウェルプレートにウェルあたり播種する細胞の量を決定します。最大25,000セルまでは、24ウェルごとにめっきすることができる。一つは、最適な播種の細胞数を決定するために、初期の実験では細胞密度の滴定を行うことができます。 表1に記載の配列（セルが早期刺激を避けるために、最後に追加されることに注意してください）​​にスナップキャップを5mLのポリスチレンチューブに文化のコンポーネントを追加します。第一ポリスチレンチューブに3.3％のメチルセルロースを追加し、ソートされた細胞が最後。 3.3％メチルセルロース溶液を策定し、16 ½ゲージ針と適切にマーク卒業シリンジでポリスチレンチューブに追加する必要があることに注意してください。一般的には、順序で正しくそのような3.3パーセントメチルセルロースゾルとして、粘稠な溶液の体積を測定するutionと最終的な文化の混合物は、それは最初の注射器にいくつかのソリューションを吸引することが重要ですし、すぐに空気を追い出すためにソリューションをプッシュ。それが引き出すのが困難である場合3.3％メチルセルロース溶液を室温まで加温しされることがあります。しかし、それはポリスチレンチューブにとマトリゲルの添加前に調剤された後に氷上で冷却されていることを確認します。 ソートされた細胞を含む半固体培地プレート。 ポリスチレンチューブのキャップを確認した後にしっかりとはまっていることを、精力的かつ徹底的に手で振らない。気泡は、このプロセス中に生成されます。 氷上で5分間または小さな気泡の表面までのチューブを置きます。 内容を吸引するために、16 ½または18 ½ゲージの針を1mLの注射器を使用してください。シリンジ内の空気なしで粘性の溶液の正確な体積を描画するために3.6.2にアドバイスに従ってください。 ゆっくり各24ウェルにメディアの500μLのを分注する。使用してください低アタッチメント24ウェルプレートのみ。ウェルの中央に直接メディアを追加します。半固形培地は、自動的にウェル中で広がっていく。各実験サンプルの場合は、quadruplicated井戸は定期的に統計的に有意な結果を得るために使用されています。のみ水平方向24ウェルプレートの4最も内側の列は、培養に使用されます。細胞含有培養の加湿を支援するために滅菌水を使用して、残りの井戸を埋める。 37℃、5％CO 2空気中で細胞をインキュベート。 成長因子の添加を遅らせた。培養開始後の成長因子を追加することが可能です。そのような作戦は、特定の成長因子の生存への影響に対処するために使用することができます。ウェルあたり100μLの成長因子のソリューションまで、26 G 3 / 8針を1 mLのシリンジにより滴下し、半固形培地中に拡散させることができる。 4。光マイクロ下でコロニー形成を観察対処細胞は単一細胞がランダムに、均等に井戸から全体に分散されることを保証するためにめっき直後に観察されるべきである。細胞または得られたコロニーのほとんどが井戸の縁に分布している場合、これは井戸に半固体培地を分注すること（セクション3.7.4を参照）あまりにも説得力があるであることが示されます。培養ウェルの余白のメニスカス効果のコロニー密度のためセンターに存在するものに比べて高くなる可能性があります。 コロニー数の定量化。メディアの3次元機能のために、コロニーは異なるフォーカルポイントで表示されます。従って、それぞれのコロニーのための焦点の調整は、光学顕微鏡により観察中に必要になることがあります。二度同じコロニーを登録しないようにするためにカウントするときに、24ウェルの下にグリッドを取り付けます。グリッドは、NUNCペトリ皿（カタログNo.169558）の壁を切断することにより得ることができる。光学顕微鏡で10倍対物レンズは、OBSに使用する必要がありますerveとコロニーを数えます。 5。代表的な結果： 以前の実験では、2.5 × 10 5マウスR1 ES細胞（50mLのメディアの合計）で始まる1が約5,000、適切なサイズの一日- 6 EBSを生成するために期待できることを示していた。 Ngn3 – EGFP ES細胞は非効率的だった; 4倍以上のセルは、6日目までに同じようなサイズのEBSを生成するために必要とされた。 25日- 6 EBSは1.88平均が含まれているため、± 0.67 × 10 5細胞、1〜約37.6 × 10 6個の細胞は5000 EBSから取得することができます。添付ファイルの培養中に細胞は2.72 ± 0.32倍の拡大が期待されています。そのため、1、5000日- 6 EBSはソート前に、約100 × 10 6日- 16細胞を得ることになります。ゲーティングした後、Ngn3 – EGFP +細胞は、合計日- 16細胞集団（プロトコルTextのセクション2.2.5および図3）の約10％を占めるようになる。 photomicrogrの例マウスES細胞由来のインスリンを発現するコロニーのaphsを図4に示されています。これらのコロニーは、独特の形態を持って、小さな、暗い、と反射光ではないコロニー内の個々のセルを持つ小さな（〜60から100ミクロン）ラウンドコロニー。私達の前の出版では、2リアルタイムRT – PCRと個別に手摘みコロニーの二重免疫蛍光染色は、インスリン、Cペプチドとグルカゴンの発現を明らかにした。これらの結果は、内分泌細胞のような原始的な第一波に似ている、同時に少なくとも二つの膵島ホルモンを含有する細胞に分化する単Ngn3 – EGFP +細胞の能力を実証する。 分散した単一細胞のためのコロニーアッセイは、 インビトロ （図5） における増殖と分化を開始する能力を持っているそれらの前駆体のための研究が可能になります。したがって、これは個々の前駆細胞の本質的な機能を測定できるアッセイである。 capabiを持つ前駆細胞インスリンを発現するコロニーになるのlityは、インスリンを発現するコロニー形成単位（ICFUs）（図5）と呼ばれている。開発膵臓のNgn3マークの内分泌前駆細胞、5 Ngn3 – EGFP +ではなく、Ngn3 – EGFPそのアイデアへの一貫した- 。MES細胞由来の集団がICFUsのために濃縮されてからセル2しかしながら、これらの前駆細胞の頻度はまだされ低い、16日目培養から単離した全Ngn3 – EGFP +人口の約0.1％〜0.6％がICFUsです2は関係なく、コロニー形成効率の明確な違いは、最高が続いNgn3 – EGFP +細胞を、期待される。その後、事前にソートされた細胞、およびNgn3 – EGFP -細胞。 図1。膵細胞様細胞へのin vitroでマウスES細胞の分化においてのタイムライン。馴化培地（CM）を生成するため、マウスESセルlsがEBSを生成するモノチオグリセロールの減少投与（次の4つの日の最初の二日間と6.0 × 10 -4 Mのための6.0 × 10 -3 M）を持つ最初の6日間で15％FCSを含む懸濁液で栽培されています。日- 6 EBの（ウェルあたり80から100）はその後、15％ノックアウト血清代替物を含む添付ファイル6ウェルディッシュに転送されます。 5％FCSは、EBSの添付ファイルを早めるために文化の日60から10の間に追加される可能性があります。ニコチンアミド、エキセンディン-4、およびヒト組み換えアクチビンβBは、培養13日目（セクション1.1を参照）上のメディアに追加されます。メディアは、培養16日目に回収され、この時点で馴化培地となっています。 16日目の細胞は、ソートおよびコロニーアッセイ用の半固体培地に播種されています。 図2大日- 6マウス胚性幹細胞由来の胚様体の代表的な顕微鏡写真。理想的な一日- 6 EBは、直径で少なくとも150μmですeterと暗くセンター（矢印）を持っている。早期膵臓前駆細胞のマーカー（などPDX – 1、Sox9を発現など）の発現は、これらのEBS（データは示さず）。3で強化されています 図3。MES細胞由来日- 16 Ngn3 – EGFP発現細胞のためのゲートをソート。 （A）セルサイズとそれぞれの粒度を示す前方と側方散乱のゲートは、非細胞破片を除去する。 （B）DAPIは40分の450フィルタで検出された405から413 nmおよび発光で励起されると陽性に染色される死細胞を、識別するために使用されます。 （C）パルス幅、電子前方散乱パルスの幅は、蛍光活性化セルソーターを通過する前に削除すべきダブレットを、明らかに。 EGFPの（D）ゲー（チャネルFL1）対などTL1（左パネル）などのコントロール親細胞株からの自家蛍光を使用して一日- 16細胞は、真の蛍光ため、Ngn3 – EGFPを照らす<> +細胞集団（右パネル）をSUP。 （E）赤の矢印は、単に偽陽性細胞の分離を高めるためにソートする前に、EGFP +ゲートの取扱説明書右シフトを示しています。に示されている（AC） – 両方（D）及び（E）のイベントは、地域（R1、R3）に基づいてゲートです。 図4代表的な半固体培養におけるインスリン発現コロニーの顕微鏡写真を。コロニーは、ランダムに分散し、小さな暗い、非光反射のクラスタとして表示されます。個々のコロニーは、後で（;ビデオを参照して図示せず）にそれぞれ、RT – PCRと免疫組織化学分析により、遺伝子と蛋白質発現についてアッセイされ得る。 図5単一の前駆細胞の機能的および定量的な評価を可能にするコロニーアッセイ。得られたコロニーの記数は、周波数を計算するために使用されます総播種した細胞の間で前駆細胞のuency。各コロニー内の細胞の組成物は、開始する前駆細胞の系統性の指標である。このアッセイを用いて、我々はマウス胚性幹細胞由来のNgn3 – EGFP +細胞はインスリンを発現するコロニー形成単位（ICFUs）、インスリンを発現するコロニーに分化する能力を持つ前駆細胞2の濃縮されたことがわかった 表1。半固体培養培地の成分と添加の順序。