膵臓のような前駆細胞がインスリンを発現するコロニーへの分化を可能にする三次元のクローン原性アッセイが記載されている。単一の前駆細胞が増殖と分化するこの方法は、メチルセルロース、マトリゲルと成長因子を含有する半固体培地を利用しています<em> in vitroで</em>、人口で機能的な前駆細胞数の定量化を可能にする。
膵臓の幹細胞や前駆細胞生物学の分野は、単一細胞の分析を可能にするin vitro機能と定量的なアッセイでの不足によって妨げられている。彼らは明確に個々の前駆細胞の系統の可能性を実証する決定的な方法を提供するため、単一の前駆細胞の解析は非常に重要です。メソッドは、単一の細胞から浮遊培養で"pancreatospheres"を生成するために考案されているが、いくつかの制限があります。最初、それは文化のメディアと空間のターンコマンドで大量の細胞の数が多い、のために単一のセルの堆積を行うために時間がかかります。結果pancreatospheresの第二、記数はpancreatosphere -開始前駆細胞の頻度が低い場合は特に、労働集約的である。第三に、pancreatosphereアッセイは、再、よく同じ文化の中で膵臓の前駆細胞の増殖と分化の両方を可能にする効率的な方法ではありませんアッセイの有用性をstricting。
これらの制限を克服するために、膵臓の前駆細胞のための半固体培地によるコロニーアッセイが開発され、本報告書で提示されます。このメソッドは、それらが増殖ならびに分化を受けるように前駆細胞が三次元空間に滞在できるように、メチルセルロースがメディアに粘度を提供するために使用されている造血コロニーアッセイ、から、既存の概念を活用します。不均一な集団からインスリンを発現するコロニー形成前駆細胞を豊かにするため、我々は急行neurogenin(NGN)3、膵内分泌前駆細胞のマーカーその細胞を利用した。マウス胚性幹(ES)強化緑色蛍光タンパク質レポーターでタグ付けさNgn3発現細胞をソートされ、ウェル当たり、多くの25000のような細胞が低添付ファイル24穴培養皿に播種した。細胞が由来次の主要コンポーネントと半固体培地の各ウェルに含まれる500μL:METhylcellulose、マトリゲル、ニコチンアミド、エキセンディン-4、アクチビンβB、および馴化培地は、マウスES細胞由来の膵臓様細胞から採取。文化8〜12日後に、独特の形態を持つインスリンを発現するコロニーが形成され、さらに各コロニーの系統構成を決定するために定量的RT – PCRとimmunoflourescent染色を用いて膵臓遺伝子発現を分析することができます。
要約すると、我々のコロニーアッセイは、不均一な細胞集団内で機能的な前駆細胞の容易な検出および定量することができます。さらに、半固体のメディアフォーマットは、in vitroで増殖し、区別するために前駆細胞を有効に、細胞に細胞外マトリックス成 分と成長因子の一様なプレゼンテーションが可能になります。このコロニーアッセイは、単一細胞レベルでの膵前駆細胞の力学的研究のためのユニークな機会を提供しています。
個々の膵前駆細胞の定量的および機能的な評価を可能にするコロニーアッセイは、非常に膵臓の幹細胞や前駆細胞生物学の研究の進展を妨げている、これまでのところ限られている。コロニーアッセイの本質は、前駆細胞の機能と系統の電位が観察できるように、本質的な前駆細胞の能力ではなく、単にそれらの表現型を測定することです。また、特定の集団に前駆細胞の数を決定することができる定量的なツールです。造血幹細胞の分野で、コロニーアッセイが同定に重要な役割を果たしただけでなく、成長因子の要件、相互作用、およびこれらの細胞の系譜のコミットメントを支配するメカニズムを解読している。膵前駆細胞の生物学の分野6、膵臓の臓器7 、8またはバルク文化9月13日考案されているが、しかしながら、このようなアッセイは、生物学的クエスティに対処していない単一細胞レベルで作成されている。単一細胞分析することなく、複数の潜在的な膵臓の幹/前駆細胞の存在が明確に立証することはできません。14
ここでは、インスリンを発現するコロニー形成前駆細胞が三次元、マトリゲルを含む、半固体培養系を用いて測定することができます。見せる懸濁培養系15,16を単一の成人の膵臓の前駆細胞が増殖し、"pancreatospheres"に分化することを可能にするどの開発されているが、我々のコロニーアッセイでは、付加的な利点を提供します。最初に、私たちの半固体培養のメディアシステムは、最大24ウェルあたり500μLの培地25,000ソートされた細胞へのメッキ線形範囲で得られたコロニーの形成を維持しながら。2は対照的に、サスペンションのpancreatosphereアッセイは、単一の使用を必要とすることが可能セルソーターによる細胞の成膜方法は、単一細胞分析を可能にするため、文化、メディアとインキュベータスペースの大きなボリュームに必要です。したがって、我々のコロニーアッセイでは、異なる多数の細胞が前駆細胞の活動のために同時に比較する必要がある場合に実施するのは比較的簡単で費用対効果です。第二に、私たちの半固形培地では増殖と分化の両方が同じウェルで発生することができる細胞外マトリックス成分と成長因子の均一な分布を、可能です。対照的に、それは、懸濁培養中の細胞にこのような環境、特に行列を、提供することより困難である。我々は2つの前駆細胞がランダムにお互いとフォームつのコロニーの近くに配置することができるように私たちの方法でそれは決定的に、各コロニーは単一の細胞から派生していることを証明することはできないことを認識しています。しかし、この問題は、単一細胞操作を用いた二次分析によって克服することができます。ソートされた単一細胞の直接手摘みでは決定的に各コロニーの単セルの原点を示すことができる。
要約では、プロのインスリン発現コロニー形成活性ここに記載さ半固形培地でgenitorsは、単一細胞レベルでの膵前駆細胞の力学的研究のためのユニークな機会を提供しています。例えば、前の報告書で我々は細胞外マトリックスを示唆し2、その培養液へのマトリゲル、細胞外マトリックス蛋白質の粗混合物を添加することはインスリン発現Ngn3 – EGFP +細胞からのコロニーの形成に必要な発見です。それらの前駆細胞の重要な。このコロニーアッセイを使用して、それは現在、さらに細かく分析し、そのような活動のための特定のマトリックスの要件を定義することが可能となります。マウス胚性幹細胞由来の前駆細胞を研究に加えて、我々は現在、in vitroのアッセイ系で 、これはまた、周産期および成体マウスの膵臓と肝臓から、同様に欠けている人間の死体膵組織由来の他の特徴的なコロニーの形成をサポートするかどうかを調査しています膵島の。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、マウスNgn3 – EGFP胚性幹細胞株、夫人ルーシーブラウンと細胞選別の支援のための分析サイトメトリーコアのプレゼントのために博士クラウスケストナーに感謝したいと思います。この作品は、MWとLSに授与訓練助成金HTKに授与NIH助成金R21DK069997とR01DK081587によってと再生医療(CIRM)のためのカリフォルニア工科大学から一部で賄われていた
Material/ Reagent | Company | Catalogue Number |
Comments |
1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech | 15-090-CV | |
Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals |
201 | Refer to Section 1.1 |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
1X Dulbecco’s PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
Bovine Serum Albumin |
Sigma | A8412 | 7.5 % |
Matrigel | Becton Dickinson |
356231 | Reduced Growth Factor |
Methylcellulose | Sinetsu Chemical, Tokyo, Japan |
1,500 centipoise (high-viscosity) |
|
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
Human Recombinant Activin βB |
R & D Systems | 659-AB-025 | |
Exendin-4 | Sigma | E7144 | |
Human Recombinant VEGF-A |
R & D Systems | 293-VE-010 | |
24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
60mm Petri Dish with Grid |
Nunc | 169558 |