تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM
Summary
ووصفت العيش تقنية التصوير مضان لقياس التجديد وتعبئة حويصلة متشابك محددة (SV) مجمعات في المحطات العصبية المركزية. ويتم رصد جولتين من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه توفير الرقابة الداخلية.
Abstract
بعد الافراج العصبي في المحطات العصبية المركزية ، ويتم استردادها بسرعة بواسطة مركبة فضاء الإلتقام. ثم يتم تعبئتها مع مركبة فضاء استرجاع العصبي والانضمام إلى التجمع إعادة التدوير ، على النحو المحدد مركبة فضاء التي تتوفر ل1،2 إيماس. عموما يمكن إعادة تدوير تجمع تقسم الى قسمين حمامات متميزة — تجمع نشره بسهولة (RRP) ، وتجمع إماراتي (RP). كما يعني أسمائهم ، ويتكون من مركبة فضاء RRP التي يتم على الفور المتاحة للاندماج في حين يتم إطلاق مركبة فضاء RP 1،2 فقط خلال التحفيز مكثفة. فمن المهم أن يكون هناك فحص تقارير موثوقة تفيد بأن عملية التجديد هذه الفرق حمامات SV من أجل فهم 1) كيف مركبة فضاء بعد مرور أنماط مختلفة من الإلتقام (مثل clathrin التي تعتمد على الإلتقام والنشاط التي تعتمد على الإلتقام بالجملة) و 2) الآليات السيطرة على تعبئة RRP على حد سواء وRP استجابة لمحفزات مختلفة.
الأصباغ وزير الخارجية وتوظف بشكل روتينياد تقرير لدوران SV كميا في المحطات العصب المركزي 3-8. لديهم ذيل مسعور المحروقات التي تسمح بتقسيم عكسها في طبقة ثنائية المادة الدهنية ، ورئيس المجموعة للماء الذي يمنع المرور عبر الأغشية. الأصباغ ومضان قليلا في محلول مائي ، ولكن عوائدها الكم يزيد بشكل كبير في الغشاء عند تقسيم 9. هكذا هي الأصباغ FM تحقيقات الفلورسنت مثالية لتتبع بنشاط إعادة التدوير مركبة فضاء. البروتوكول القياسي للاستخدام صبغة FM هي على النحو التالي. الأولى هي تطبيقها على الخلايا العصبية ويتم تناولها خلال الإلتقام (الشكل 1). بعد غسلها غير المنضوية صبغة بعيدا عن غشاء البلازما وإعادة تدويرها ، إعادة توزيع داخل مركبة فضاء تجمع إعادة التدوير. ونضبت ثم باستخدام هذه المحفزات تفريغ مركبة فضاء (الشكل 1). منذ FM صبغة وسم مركبة فضاء غير كمي 10 ، وتراجع الناتج مضان يتناسب مع كمية من الحويصلات الافراج عنهم. وهكذا ، ولدت إعادة التدوير وانصهار مركبة فضاء من العلاقات العامةويمكن لجولة evious الإلتقام كميا بشكل موثوق به.
هنا ، نقدم البروتوكول الذي تم تعديله للحصول على عنصرين إضافية للمعلومات. أولا ، يتم استخدام المنبهات متتابعة التفريغ لتفريغ بالتفاوت في RRP وRP ، والسماح الكمي لتجديد حمامات SV محددة. ثانيا ، كل محطة يمر العصب البروتوكول مرتين. وبالتالي ، يمكن مقارنة استجابة العصب نفسه في محطة S1 ضد الوجود من مادة الاختبار في المرحلة S2 (الشكل 2) ، وتوفير الرقابة الداخلية. هذا هو المهم ، لأن مدى إعادة التدوير SV عبر محطات مختلفة العصب هو متغير جدا 11.
ويمكن استخدام أي ملتصقة الثقافات العصبية الأساسي لهذا البروتوكول ، ولكن يتم تحسين كثافة الطلاء والحلول والشروط لتحفيز الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ (CGNs) 12،13.
Protocol
Discussion
وتستخدم على نطاق واسع الأصباغ وزير الخارجية للتحقيق في وظيفة الأعصاب الطرفية في الاستعدادات العصبية كثيرة. وقد استخدمت بصورة رئيسية لرصد مدى إما الإلتقام SV ، دوران SV أو حركية إيماس 6. بروتوكول صفها تمتد هذه الدراسات لدراسة الفرق تفريغ أحواض SV محددة. وهذا يوفر معلومات إضافية بخصوص تجديد حمامات SV وكذلك مداها التعبئة.
ويمكن استخدام الأصباغ وزير الخارجية لتسمية جولات متعددة من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه. استغلت هذه الخاصية ونحن تصميم البروتوكولات التي يمكن رصدها SV دوران في كل محطة طرفية مرتين في العصب نفسه. هذا يتيح مراقبة دقيقة الداخلية ، وهو أمر ضروري نظرا للطبيعة غير متجانسة من إعادة التدوير في محطات SV العصبية الموازية 11. عبر استخدام المرحلة S1 باعتبارها الرقابة الداخلية ، وإعادة تعبئتها من RRP ، RP واجمالىيمكن SV تجمع في وجود مخدرات موثوق بها ومباشرة مقارنة.
بالإضافة إلى توفير المعلومات عن حجم المطلقة لإعادة التدوير ، وRRP RP حمامات التحفيز في ظل ظروف مختلفة ، ويمكن لهذا البروتوكول أيضا توفير البيانات عن بعد — 1) وتقسيم بين مركبة فضاء وRRP RP بوصفها وظيفة من تجمع التدوير ل2 ، S1 و S2) الحجم النسبي للحمامات S2 (RRP وRP) بوصفها وظيفة من مجموع بركة التدوير S1 و 3) الحجم النسبي في أي تجمع SV المعرفة في S2 بوصفها وظيفة من نفس المجموعة في S1. وهذا البروتوكول ولا سيما عدم تقديم معلومات عن حركية التفريغ ولكن ، منذ ذلك الوقت اقتناء بطيء جدا (لقياس الحركية مرات الاستحواذ يجب أن يكون سريعا بقدر الإمكان والتفريغ تلقائيا مزامنة لالتقاط الصورة).
لدينا 30 هرتز 2 المحفزات ليالي يستحضر حد ما متطابقة من RRP التفريغ لالسكروز مفرط التوتر 8. منذ حجم RRPتم تعريفها بواسطة السكروز مفرط التوتر تفريغ 15 ، يمكننا أن نقول أن هذا البروتوكول افرغت كل مركبة فضاء RRP ، بالاتفاق مع الخلايا العصبية في قرن آمون الدراسات 16. تماما تقريبا استنزاف الاحتياطي التي تجمع ثلاثة قطارات من 400 المنبهات (40 هرتز كل 10 ثانية) منذ هذا التحفيز افرغت مبلغ مماثل من صبغ لنموذج (2 المحفزات مع بوكل 50 مم) التي تستنزف 95 ٪ من جميع مركبة فضاء صبغ المسمى 8،17. تقدير دقيق لحجم RRP على حد سواء وحمام سباحة احتياطي يعتمد أيضا على الحصول على المعلومات ضمن مجموعة ديناميكية الخطية للكاميرا CCD.
ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسيطة مزيد من التعديل. يمكن أيضا أن قوة من المحفزات التحميل تكون متنوعة لتحديد مدى نشاط الخلايا العصبية وطرق مختلفة تؤثر الإلتقام SV تجديد حوض السباحة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أكبر من دورتين من التحميل والتفريغ أن يؤديها إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول في خلايا transfected إما مع أو overexpressionناقلات shRNA. نظرا لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن الثقافات العصبية الأولية ، لا بد من البروتينات وأعرب المفتاحية مع البروتينات الفلورية. فمن الضروري أن هذه العلامات الفلورية لا تتداخل مع الإشارة صبغ FM (سماوي أو استخدام البروتينات الحمراء ، على سبيل المثال). في هذه الحالة ، يمكن أيضا من الخلايا العصبية الطرفية وغير transfected transfected في نفس الحقل للعرض يمكن مقارنة كعنصر تحكم إضافية 8. في مثل هذه التجارب المقارنة بين مدى التحميل بين الاحمال وS1 S2 غير ذات قيمة تذكر ، لأن وجود اضطراب في كلتا الأحمال. يمكن تقسيم بين صبغ أحواض SV يزال من الممكن تصور ولكن 8.
ودعا الصحفيين وراثية ويمكن أيضا أن تستخدم لpHluorins رصد إيماس SV الإلتقام في الثقافة والعصبية الأولية. هذه التحقيقات استخدام درجة الحموضة حساسة للبروتين الفلورية الخضراء للبيئة درجة الحموضة من المجالات اللمعية من البروتينات SV المفتاحية مثل VAMP ، وsynaptophysin VGLUT1 18 </suع>. عندما تستخدم بالاقتران مع مثبطات أتباز الحويصلي ، يمكن pHluorins التقرير كلا من حركية ومدى تعبئة تجمع SV 19. النهج FM – صبغة تستند الموصوفة هنا لديه بعض المزايا على أسلوب pHluorin ، أولا ، والأصباغ وزير الخارجية تقديم معلومات عن الوضع الذي SV الإلتقام تغذي RRP وبرك الاحتياطي 8. ويمكن تسمية محددة ثانيا حمامات SV FM مع الأصباغ التي لها خصائص مختلفة الأطياف 20 وأخيرا لا يوجد أي شرط لترنسفكأيشن. يمكن الأصباغ وزير الخارجية لا توفر معلومات عن حركة المرور SV بين الراحة وإعادة تدوير حمامات SV لكن (على النقيض من pHluorins 19) ، ومنذ ذلك الحين مركبة فضاء التعريف يجب أن تكون محملة صبغ خلال الإلتقام أن تكون مرئية. وبالتالي كل من وزير الخارجية والأصباغ pHluorins لها من القوة والضعف وأقوى عندما تستخدم في تجارب مستقلة لمعالجة مسألة واحدة.
صور عالية الجودة ضرورية للتحليل صحيح وreproducibالنتائج جنيه. في حين يمكن بسهولة تصحيح الانحراف الأفقي ، لا يمكن أن التجارب التي يوجد فيها انحراف في المحور Z يمكن استردادها. لهذا السبب ، فإنه من الأهمية بمكان إعادة تركيز الصور قبل البدء S1 و S2 افرغت. في الحالات عندما تسوس كبيرة الفلورسنت حدث ، يجوز تطبيق التصحيحات تسوس (عادة من خلال طرح تتبع المسجلة مسبقا من وزير الخارجية محملة الخلايا في غياب التحفيز). ومع ذلك ، فمن المقترح أن يتم تنفيذ سوى تصحيح تسوس لتمثيل رسومي وليس لاستخدامها في أي تحليل كمي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من ويلكوم ترست (المرجع : 084277).
Materials
| Name | Company | Catalogue no. |
|---|---|---|
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
| Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
| Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
| Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
| Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
| Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
| Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
| Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
| Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Solution B | – | – | 19 ml |
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Solution C | – | – | 3.2 ml |
| Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | – | – | 10 ml |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
| Name | Version | Company |
|---|---|---|
| AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
| ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
| Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
| Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
|---|---|---|---|
| CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
