Een standaard aanpak voor volwassenen voor te bereiden<em> Drosophila</em> Ogen voor semi-dun snijden en licht microscopische analyse wordt hier gepresenteerd. Het protocol kan worden gebruikt voor grove morfologische analyse van oogafwijkingen, of met de aangegeven aanpassingen kunnen worden gebruikt om genetische eisen van de genen in specifieke celtypen van het oog (bijv. klonale analyse van de fotoreceptoren) of voor elektronen microscopische analyse te bepalen.
Drosophila is lange tijd gebruikt als modelsysteem om ontwikkeling te bestuderen, vooral te danken aan het gemak waarmee het genetisch handelbaar. In de loop der jaren, hebben een overvloed aan gemuteerde stammen en de technische trucs ontwikkeld om ingewikkelde vragen worden gesteld en beantwoord in een redelijke hoeveelheid tijd. Fundamenteel inzicht in het samenspel van onderdelen van alle bekende grote signaalwegen is verkregen in voorwaartse en omgekeerde genetische Drosophila studies. De vlieg oog heeft bewezen uitstekend geschikt zijn voor mutatie-analyse, omdat, onder laboratoriumomstandigheden, vliegen kan overleven zonder functionele ogen. Bovendien is het oppervlak van het insect oog bestaat uit zo'n 800 individuele eenheid ogen (facetten of ommatidia) die een regelmatige, glad oppervlak vormen wanneer bekeken onder een microscoop dissectie. Zo is het gemakkelijk om te zien of er een mutatie zou kunnen ogen ontwikkeling of groei beïnvloeden door extern op zoek naar het verlies van de gladde oppervlak ('ruw eye' fenotype, Fig 1.) Of de totale grootte van het oog, respectievelijk (voor voorbeelden van schermen op basis van externe oog morfologie zie bijv. 1). Latere gedetailleerde analyses van het oog van fenotypes nodig fixatie, plastic inbedding en dunne-snijden van de volwassen ogen.
De Drosophila oog ontwikkelt zich uit de zogenaamde eye verbeelding schijf, een zak van epitheliale cellen die prolifereren en differentiëren tijdens het larvale en popstadium fases (voor review zie bv 2). Elk ommatidium bestaat uit 20 cellen, waaronder acht fotoreceptoren (PR of R-cellen. Fig. 2), vier lens-afscheidende kegel cellen, pigment cellen ('zeshoek' rond R-cell cluster) en een varkenshaar. De fotoreceptoren van elke ommatidium, het meest gemakkelijk te herkennen door hun lichtgevoelige organellen, de rhabdomeres, zijn georganiseerd in een trapezium bestaande uit de zes "buitenste" (R1-6) en twee 'innerlijke' fotoreceptoren (R7 / 8; R8 [Fig 2.] is onder R7 en dus alleen gezien in de paragrafen uit diepere delen van het oog). De trapezium van elk facet is precies afgestemd op die van haar buren en de algemene achterwaartse en dorsoventral assen van het oog (Fig. 3A). Met name de ommatidia van de dorsale en ventrale (zwarte en rode pijlen, respectievelijk) helften van het oog zijn spiegelbeelden van elkaar en komen overeen met twee chirale vormen vastgesteld tijdens planaire celpolariteit signalering (voor review zie bijv. 3).
De methode om semi-dunne eye secties te genereren (zoals die voorgesteld in Fig. 3) die hier beschreven is enigszins gewijzigd van de ene oorspronkelijk beschreven door Tomlinson en Ready 4. Het laat de morfologische analyse van alle cellen, behalve voor de transparante kegel cellen. Daarnaast kan het pigment van de R-cellen (blauwe pijlen in Fig. 2 en 3) gebruikt worden als een cel-autonome marker voor het genotype van een R-cel, waardoor genetische eisen van de genen in een subset van R-cellen kunnen eenvoudig worden bepaald 5,6.
Met behulp van Drosophila als modelorganisme, genetische screens geleid tot de identificatie van veel van de stichtende leden van genfamilies essentieel zijn voor het grootste deel van de sterk geconserveerde signaalwegen in hogere eukaryoten inclusief de mens. Aangezien onder laboratoriumomstandigheden, een functioneel oog is overbodig om te overleven, het oog is een bijzonder goed geschikt weefsel voor de ontdekking van nieuwe genen functies en de beoordeling van de genetische netwerken. Ultrastructurele analyse van de vlieg oog met behulp van de beschreven methode dus geleid tot fundamentele ontdekkingen relevant zijn voor ontwikkeling en ziekte. Aanvankelijk werd enkele cel klonale analyse uitgevoerd met behulp van X-ray veroorzaakte klonen in combinatie met bekende nauw verbonden cel-autonome recessieve markers. Meer recent is de beschikbaarheid van de FLP / FRT systeem om klonen te genereren aanzienlijk vergemakkelijkt de fenotypische analyse van de dodelijke mutaties in het oog van secties 6,9.
Analyse van de ogen delen is niet beperkt tot tangentiële secties hier beschreven. Indien gewenst, kan de koppen worden uitgelijnd in elke richting in de matrijzen en dwarsprofielen kunnen worden verkregen naar diepere lagen in het hoofd, zoals de lamina en merg te bestuderen. Het protocol hier beschreven is dus een veelzijdige methode voor analyses van het oog en hoofd structuren Drosophila volwassenen.
The authors have nothing to disclose.
Ik wil graag Dr Jennifer Curtiss bedanken voor de foto's in Fig. 1 en Jeremy Fagan en Dr Florence Marlow voor het kritisch lezen van het manuscript. Ons werk wordt ondersteund door NIH subsidie 1R01GM088202.
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
---|---|---|
Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials