Summary

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Published: June 21, 2011
doi:

Summary

אנו מציגים גישה חדשנית לכמת לוקליזציה nanoparticle ב vasculature של גידולים xenografted אנושי באמצעות דינמי, בזמן אמת הדמיה intravital במודל העובר העופות.

Abstract

טכנולוגיות הדמיה נוכחית הגידול, כגון אולטראסאונד, MRI, PET ו-CT, אינם מסוגלים להניב תמונות ברזולוציה גבוהה להערכת ספיגת nanoparticle בגידולים ברמה המיקרוסקופית 1,2,3, המדגיש את התועלת של מודל xenograft מתאים שבו לבצע ניתוחים ספיגת מפורט. כאן, אנו משתמשים ברזולוציה גבוהה הדמיה intravital להעריך ספיגת nanoparticle ב xenografts סרטניים אנושיים במודל שונה, העובר פגז פחות עוף. המודל עובר העוף במיוחד היטב מתאים אלה מנתח vivo משום שהוא תומך צמיחה של גידולים אנושיים, הוא זול יחסית ואינו דורש הרדמה או ניתוח 4,5. תאים סרטניים בצורה מלאה xenografts vascularized בתוך 7 ימים, כאשר מושתלים לתוך קרום chorioallantoic (רמ"א) 6. גידולים וכתוצאה מכך הם דמיינו ידי הדמיה לא פולשנית בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה אשר יכול להישמר לתקופה של עד 72 שעות עם מעט השפעה על המארח או מערכות גידול. חלקיקים עם מגוון רחב של גדלים ניסוחים מנוהל דיסטלי אל הגידול ניתן דמיינו לכמת כמו זרימת הם דרך מחזור הדם, extravasate מ vasculature הגידול דולפים, ולצבור באתר הגידול. אנו מתארים כאן את הניתוח של חלקיקים שמקורם וירוס פסיפס Cowpea (CPMV) מעוטרת קרוב אינפרא אדום צבעי ניאון ו / או פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG) 7, 8, 9,10,11. עם עירוי לוריד, חלקיקים אלה הם הפנימו במהירות ויראלי ידי לתאי אנדותל, וכתוצאה מכך תיוג גלובלית של vasculature הן מחוץ ובתוך 7,12 הגידול. PEGylation של חלקיקים נגיפיים מגביר פלזמה שלהם זמן מחצית החיים, מרחיב את זמנם במחזור הדם, ובסופו של דבר משפר את הצטברות שלהם בגידולים באמצעות חדירות משופרת (EPR) אצירת אפקט 7, 10,11. השיעור וההיקף של הצטברות של חלקיקים הגידול נמדד לאורך זמן באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. טכניקה זו מספקת שיטה הן לחזות ולכמת הדינמיקה nanoparticle בגידולים אנושיים.

Protocol

1. הרכבה של הגידול לתוך CAM העובר העופות הכן פגז פחות עוברי תרנגולת מופרית כפי שתואר 8. ביום 9 של ההתפתחות העוברית, להרכיב מיקרו הזרקה באמצעות מחט 18-מד מחובר על מזרק 1 מ"ל. לחתוך 5-6 ס"מ חתיכת צינור Tygon (1 / 32 "קוטר פנימי, 3 / 32" קוטר חיצוני, 1 / 32 "עובי דופן) בזהירות להכניס שפוע של מחט לתוך צינורות. כ 4-5 ס"מ של צינורות צריך להאריך מקצה המחט (איור 1 א). מלאו את המזרק צינורות עם ההשעיה התא. לאחר מכן, הכנס מחט זכוכית microinjection בסוף בצינור ובזהירות להסיר בועות אוויר. הזרק יום 9 עוברי (איור 1b) תחת בהיקף דיסקציה עם המאייר עם 10,000-100,000 תאים סרטניים כמו בולוס בתוך CAM (איור 1 ג'). לאט לאט ובזהירות להזריק תאים להבטיח כי המחט נמצאת במקום הנכון עבור התאים לצורה בולוס גלוי בתוך CAM. תאים לטפטף על פני השטח CAM ניתן לנקות באמצעות המוליך Kimwipe או אחר. חזור אל העוברים באינקובטור humidified ב 38 ° C לחות על 60% ולאפשר הגידול לגדול vascularize (עד 7 ימים). 2. הכנה של חלקיקים כדי להכין שכותרתו fluorescently חלקיקים CPMV עבור הזרקה לתוך העובר עוף; לדלל את חלקיקים נגיפיים (מסונתז כמו 8 ב-PBS, pH 7.4, ריכוז של 100 מיקרוגרם תערובת / ml וורטקס היטב לפני השימוש ו צנטריפוגות במשך דקה אחת כדי להסיר. אגרגטים. Sonication יכול להיות גם שימושי, תלוי conjugates ומידת צבירה. מניות של CPMVs שכותרתו fluorescently יציבים במשך שנה לפחות 1 כאשר מאוחסנים 4 ° C בחושך. בדוק מניות מעת לעת על ידי הצבת כמה טיפות לשקופית זכוכית בדיקת הקרינה. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) יכול לשמש גם כדי לקבוע אם חלקיקים נותרו על כנן לאחר הצמידה. בקצרה, אחד מיקרוגרם של חלקיקים נגיפיים (נפח סופי של μl 2) ניתן להוסיף רשתות נחושת מצופה. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של אצטט uranyl 2% למשך דקה 1 על מיקרוסקופ אלקטרונים (פיליפס EM 410). 3. הזרקה תוך ורידי של חלקיקים נגיפיים fluorescently שכותרתו ביום 16, להרכיב מיקרו ההזרקה כפי שתואר לעיל. צייר את העוצמה הרצויה של nanoparticle ויראלית דרך צינורות לתוך המזרק (> 200 μL). בזהירות להסיר את כל בועות האוויר. הכנס זכוכית מחט microinjection בסוף הצינור. ודא כי המחט היא עוד והצרות ככל האפשר (איור 2 א). אם המחט היא בוטה מדי, הוא לא יוכל לחדור מבעד האאקטודרם ו ייכשל לחדור אל הספינה. אם המחט היא חדה מדי, טיפ תקרוס כאשר חודר לרקמות. להזריק לווריד 100 μl של 1 מ"ג / מ"ל ​​והעמסת dextran (MW 70,000 דא, Invitrogen) לתוך העובר הנושאת גידול דיסטלי מאתר הרצוי להיות דמיינו (איור 3d). Cannulation מוצלח של וריד CAM ניכר ידי ניקוי הדם בנתיב הזרימה הזרקה (איור 2b). הערכת כלי דם דליפה 1 שעה לאחר ההזרקה. להזריק לווריד 50 μl של 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון של CPMV-Alexa פלואוריד 647 (CPMV AF-647) או PEGylated CPMV-Alexa פלואוריד 647 (CPMV-PEG-AF 647) לעוברי המכיל גידולים עם כלי דם דליפה דיסטלי מהאתר הרצוי להיות דמיינו. תמונה גידולים מיד וכל שעה לאחר ההזרקה באמצעות בוחן Zeiss Z1 מיקרוסקופ זקוף מצויד בדיסק Yokogawa ספינינג, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD המצלמה. 4. בזמן אמת הדמיה intravital כדי להרכיב את יחידת ההדמיה העובר, למרוח שכבה דקה של שומן ואקום סביב היקף של הנמל הדמיה על החלק התחתון של המכסה של יחידת ההדמיה העובר, ובכושר 18 מ"מ זכוכית coverslip על הנמל. מקם את העובר כך coverslip יכסה את האזור הרצוי עבור הדמיה. לאט לאט להוריד את המכסה עד coverslip רק יוצר קשר עם העובר, ולאחר מכן להבריג את המכסה על היחידה כדי להחזיקו במקום (איור 2 ג). מוסיפים מים מחוממת 37 מעלות צלזיוס ליחידה העובר הדמיה מחוץ מאכל המכיל את העובר, ולאחר מכן למקם את היחידה כולה על הבמה של מיקרוסקופ confocal זקוף עם תא סביבתיים בתוך equilibrated עד 37 ° C. מיקום הדמיה היחידה המכילה את העובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ספינינג דיסק confocal (2e איור). יחידת הדמיה תחזיק את העובר במקום לשמור את שדה הראיה קבוע בעת לכידת תמונות, המאפשרת גם תלת מימדי ערימות Z ו – זמן לשגות תמונות כדי ליפול בפח. אנו לרכוש ולנתח תלת ממדי זמן לשגות תמונות באמצעות פרקין אלמר של (לשעבר אימפרוביזציה) Volocity חבילת תוכנה (איור 3a). לרכוש ברזולוציה גבוהה תלת ממדי ערימה של הגידול ואת כלי הדם שמסביב לדמיין detaileד מנתח מבניים בזמן נקודות ספציפיות. רוכשת תלת ממדי ערימות בזמן נקודות קבוע למפות השינויים המבניים המפורטים בכלי הדם של הגידול. גידולים תמונה כל שעה לאחר ההזרקה. לכמת את ספיגת של חלקיקים נגיפיים על ידי חישוב ממוצע אלקסה פלואוריד (AF) 647 אות בתוך אזורים נבחרים הגידול או את התוכנה stroma (שאינם סרטניים באזור) באמצעות תמונה quantitation כגון Volocity (פרקין אלמר). הגידול יחס stroma היה מחושב על ידי חלוקת אומר AF 647 אות בגידול מעל האות כלומר 647 AF ב stroma. יחס הגידול / stroma גבוה יותר מאשר 1 מציין כי nanoparticle הוא נלקח על ידי הגידול. 5. נציג התוצאות: בדוגמה המתוארת כאן, אנו מזריקים HT-29 בתאי סרטן המעי הגס כדי ליצור בולוס כ 1mm בגודל בתוך CAM של 9 יום עוברי תרנגולת (איור 1b). לאחר חיסון, העוברים היו בתרבית למשך 7 ימים בתוך חממה humidified להתיר הגידול כלי דם מספקת (איור 1 ג'). עוברים היו מוזרק לווריד עם משקל מולקולרי נמוך dextran לאשר כלי דם סרטניים, גידולים היו דמיינו תחת מיקרוסקופ AxioExaminer Z1 Zeiss זקופה (איור 2). לאחר עירוי לוריד של CPMV AF-647 או CPMV-PEG-AF 647 חלקיקים (איור 3 א ו – ב), ברזולוציה גבוהה חשף בזמן אמת confocal הדמיה (2e איור) כי הן CPMV CPMV ו-PEG חלקיקים שכותרתו במהירות vasculature כולו, אבל את ספיגת של CPMV-PEG על ידי הגידול היה כ 3 פעמים גבוה יותר מאשר CPMV לאחר 12 שעות (איור 3 א). ספיגת הגידול היחסי של חלקיקים נקבע באמצעות ניתוח התמונה תוכנה (Volocity מן פרקין אלמר). אזורים של עניין נבחרו ומחוצה הגידול (בתא סטרומה) ​​ואת עוצמת הקרינה הממוצע של כל אחד נקבע. נתונים מבוטא יחס הגידול / stroma. באיור 1. Microinjection של גידולים תוך CAM של העובר העופות. (א) מנגנון microinjection מורכב מן הרכיבים כפי שצוין. (ב) עוברי העופות ביום 9 מוכנים להיות מחוסן עם הגידול כאשר CAM התפשט לכסות את כל פני השטח. (ג) בשעה 16 יום, הגידול יהיה גדלו עד 1 ס"מ קוטר (קו מקווקו) והוא מוכן להזרקה עם חלקיקים. איור 2. הזרקה Nanoparticle הדמיה intravital. הזרקה תחת מיקרוסקופ לנתיחה מראה (א) את קצה המחט microinjector מוכן להיות מוזרק לווריד CAM ו (ב) את המחט microinjector המוחדרת לווריד (מסומן בחץ) חלקיקים מוזרק זרימת הדם (ראו ידי ניקוי של דם). (ג) העובר המכיל יחידת דימות עם העופות coverslip interfaced ישירות עם רמ"א. (ד) לפני הזרקת nanoparticle, כלי הדם הגידול הוערכה באמצעות הדמיה intravital לאחר ההזרקה של והעמסת dextran. (ה) יחידת ההדמיה העובר המכיל את מיקומו על הבמה של מיקרוסקופ confocal זקוף בתוך קבוצת בטמפרטורה מוסדר המתחם עד 37 ° C. איור 3. להדמיה Intravital של ספיגת nanoparticle בגידולים אנושיים. גידולים הם דמיינו 7 שעות לאחר ההזרקה של (א) CPMV-AF647 ו (ב) CPMV-PEG-AF647. ד) כריתה של הגידול מעובר העופות לניתוח שלאחר מכן.

Discussion

קרום chorioallantoic (רמ"א) של העובר העופות הוא מודל שימושי כדי להעריך את הדינמיקה של כלי הדם והפרמקוקינטיקה של גידולים אנושיים. המבנה והמיקום של CAM מאפשרת רכישת תמונה באיכות גבוהה מתאים של סוגים רבים של סרטן xenografts ללא ניתוחים פולשניים. יתר על כן, הגידול xenografts סרטן מושתלים לתוך קרום chorioallantoic להיות vascularized בתוך 7 ימים, המציע מהיר, אמצעי זול למחצה תפוקה גבוהה כדי להעריך את הצטברות של חלקיקים רקמת הגידול. מאז xenografts סרטן מושתל CAM של פגז פחות עוברי תרנגולת נגישים ברזולוציה גבוהה אופטיקה של מיקרוסקופ epifluorescence או confocal זקוף, מידע הקשרי ובזמן לגבי ספיגת nanoparticle ב vasculature הגידול ניתן להשיג בקלות. Xenografts סרטן במודל זה נוטים לגדול רוחבית לאורך CAM, וכתוצאה מכך גידולים גדולים תוך שמירה על פחות מ -200 מ 'עומק. זה עושה להם טוב במיוחד מתאים הדמיה intravital כי מיקרוסקופים epifluorescence רגיל יכול למעשה לחדור את המסה הגידול כולו. לעומת זאת, גידולים מושתל או אתרי שטחית או orthotopic בתוך העכבר להתרבות בשלושה ממדים, ולכן קשה למקם במדויק חלקיקים עמוק בתוך גידולים אלו על ידי טכניקות פולשנית. אנחנו צריכים לנצל את המודל הזה כדי להעריך את ספיגת הנקודות, ליפוזומים הקוונטים, תחמוצת ברזל חלקיקים במספר xenografts הגידול האנושי, המדגיש את פוטנציאל עבור דגם זה להיות מתאים לניתוח vivo של מגוון רחב של ניסוחים nanoparticle.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי CCSRI גרנט # 700537 ו CIHR גרנט # 84535 כדי JDL NIH ו / NCI מענק # CA120711 ו-01A1-01A1 CA120711 ל AZ. כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות והנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש ועדת באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו, טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת מערב אונטריו.

Materials

Reagent Name/Equipment Company Catalogue Number Comments
Fertilized leghorn eggs Frey`s Hatchery, St. Jacobs N/A  
Dremel rotary tool Dremel   Can used any model
Dremel cutoff wheels no. 36 Dremel 409  
Sportsman hatcher Berry Hill 1550HA  
Sportsman incubator Berry Hill 1502EA  
Ethanol     70% (vol/vol)
Polystyrene weigh boats VWR 12577-01  
Square Petri dishes Simport, VWR 25378-115  
Rubbermaid rubber container with lid Guillevin RH3-228-00-BLU holes drilled into sides
Vertical pipette puller David Kopf Instruments model 720 Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid)

Sodium borosilicate glass capillary tubes

Sutter Instrument BF100-58-10

(OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm

length)
1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11995073  
Dulbecco’s Invitrogen 14190250 pH 7.4
Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid      
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300054  
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12483-020 Heat inactivate
Hemocytometer Hausser Scientific, VWR 15170-090  
Centrifuge Eppendorf model 5810R 5811 000.010  
Fine-point forceps VWR 25607-856  
Tygon R-3603 tubing VWR 63009-983 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness
Hypodermic needles for injections 18-gauge needles BD 305195 Box of 100
1 ml syringes for injections BD 309602 Box of 100
Fiber-optic microscope illuminator Amscope HL250-AY 150W
kimwipes VWR 10805-905  
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A  
Indoor growth lights SunLite, Gardener’s Supply    
Methyl-PEO4-NHS ester Pierce PI22341  
mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 NANOCS PEG1-0002  
Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) Invitrogen A20006  
Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * Invitrogen O-6149  
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418  
Dibasic monohydrogen phosphate Sigma 379980 K2HPO4 (for phopshate buffer)
Monobasic dihydrogen phosphate   P5655 KH2PO4 (for phopshate buffer)
Superose 6 size-exclusion column GE healthcare life sciences 17-0673-01  
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Amersham Pharmacia WS-AKTA100  
ÄKTA high flow kit GE healthcare life sciences 18-1154-85  
Sucrose Sigma S0389  
Ultracentrifuge Beckman    
SW 28 Ti rotor Beckman 342204 Swing bucket
50.2 Ti rotor Beckman 337901 Fixed angle
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore UFC910008 100 kDa cut off
Gradient former Biorad    
dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic Invitrogen D1823  
Spinning disk confocal fluorescence microscope Quorum; Yokogawa
CSU 10, Yokogawa
N/A  
Epifluorescence wide-field microscope Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss N/A  
Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera Quorum; Hamamatsu N/A  
Temperature enclosure unit for microscope Precision Plastics N/A  
Vacuum grease VWR 59344-055  
Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) VWR 16004-300  
Volocity software Perkin Elmer    
Chick embryo enclosure   custom fabricated  
Delicate scissors VWR 25608-203  
Formalin Bioshop FOR201.500 Use in fumehood
Optimal Cutting Fisher; Tissue Tek 1437365  
Temperature (OCT)      
Plastic moulds Fisher 22-038217  
VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides VWR 16004-406  
Prolong gold with DAPI Invitrogen P36931  
Disposable blades for cryostat Fisher 12-634-2  
Cryostat Leica CM 3050 S 14047033518  

References

  1. Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
  2. Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
  5. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  6. Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
  7. Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
  8. Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
  9. Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
  10. Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
  11. Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
  12. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Cho, C., Ablack, A., Leong, H., Zijlstra, A., Lewis, J. Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging. J. Vis. Exp. (52), e2808, doi:10.3791/2808 (2011).

View Video