تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital
Summary
نقدم نهجا جديدا لقياس توطين جسيمات متناهية الصغر في الأوعية الدموية للأورام xenografted الإنسان باستخدام الحيوية ، في الوقت الحقيقي التصوير intravital في نموذج جنين الطيور.
Abstract
التكنولوجيات الحالية للتصوير الورم ، مثل الموجات فوق الصوتية والتصوير بالرنين المغناطيسي ، والتصوير المقطعي PET ، غير قادر على العائد صور عالية الدقة لتقييم امتصاص جزيئات النانو في الأورام على المستوى المجهري 1،2،3 ، تسليط الضوء على فائدة نموذج مناسب طعم أجنبي فيه لإجراء تحليلات مفصلة امتصاص. هنا ، ونحن نستخدم عالية الدقة intravital التصوير لتقييم امتصاص جزيئات النانو في xenografts الإنسان في الورم ، تعديل نموذج جنين قذيفة أقل الدجاج. وبخاصة نموذج جنين الدجاج مناسبة تماما لهذه التحليلات في الجسم الحي لأنها تدعم نمو الأورام الإنسان ، وغير مكلفة نسبيا ولا تحتاج إلى تخدير أو عملية جراحية 4،5. شكل خلايا الورم بشكل كامل xenografts أوعية دموية في غضون 7 أيام عندما زرعت في غشاء مشيمائي (CAM) 6. الأورام الناتجة تصور من غير الغازية التصوير في الوقت الحقيقي ، وارتفاع القرار الذي لا يمكن الحفاظ عليه لمدة تصل إلى 72 ساعة مع تأثير ضئيل على استضافة أو نظم الورم. النانوية مع طائفة واسعة من الأحجام والتركيبات تديرها البعيدة للورم يمكن تصور وكميا لأنها تتدفق من خلال مجرى الدم ، ويتسرب من الأوعية الدموية ورم راشح ، وتتراكم في موقع الورم. نحن هنا وصف تحليل النانوية المستمدة من فيروس تبرقش اللوبيا (CPMV) مزينة الأشعة تحت الحمراء القريبة الأصباغ الفلورية و / أو بوليمرات البولي ايثيلين جلايكول (PEG) 7 ، 8 ، 9،10،11. على الادارة في الوريد ، وهذه الجسيمات النانوية المنضوية بسرعة الفيروسية من الخلايا البطانية ، مما أدى إلى وضع العلامات العالمية في الأوعية الدموية سواء خارج وداخل 7،12 الورم. PEGylation من زيادات جزيئات فيروسية البلازما الخاصة بهم نصف الحياة ، ويمتد وقتهم في الدورة الدموية ، ويعزز في نهاية المطاف تراكمها في الأورام عن طريق تحسين نفاذية والاستبقاء (EPR) تأثير 7 ، 10،11. يتم قياس معدل ومدى تراكم النانوية في الورم على مر الزمن باستخدام برمجيات تحليل الصور. هذا الأسلوب يوفر طريقة لقياس كل من تصور وديناميات جسيمات متناهية الصغر في الأورام الإنسان.
Protocol
Discussion
غشاء مشيمائي (CAM) من جنين الطيور نموذجا مفيدا لتقييم ديناميات الوعائية والدوائية للأورام البشرية. هيكل وموقف يسمح CAM عالية الجودة والحصول على الصور من يستوعب العديد من أنواع السرطان من دون xenografts العمليات الجراحية الغازية. علاوة على ذلك ، xenografts ورم السرطان المزروع في غشاء مشيمائي تصبح أوعية دموية في غضون 7 أيام ، وتقدم سريع وغير مكلف وشبه عالية الإنتاجية إلى تقييم تراكم النانوية في الأنسجة السرطانية. ويمكن منذ xenografts سرطان زرع في لأجنة الدجاج CAM قذيفة أقل متاحة للبصريات ذات دقة عالية لمجهر أو تستقيم epifluorescence مبائر والمعلومات السياقية والزمنية المتعلقة امتصاص جسيمات متناهية الصغر في الأوعية الدموية السرطانية يمكن الحصول عليها بسهولة. xenografts السرطان في هذا النموذج تميل إلى النمو أفقيا عبر CAM ، مما أدى في الأورام التي تكون كبيرة في حين تبقى أقل من 200 متر في عمق. هذا يجعلها مناسبة بصفة خاصة للتصوير intravital لأن المجاهر epifluorescence معيار يمكن ان تخترق بشكل فعال كتلة الورم بأكمله. في المقابل ، الأورام مزروع في مواقع إما سطحية أو مثلي داخل الماوس تتكاثر في ثلاثة أبعاد ، مما يجعل من الصعب حصر دقيق النانوية عميقة داخل هذه الأورام من غير الغازية التقنيات. وقد استخدمت هذا النموذج نحن لتقييم امتصاص نقاط الكم ، والجسيمات الشحمية ، وأكسيد الحديد النانوية في عدد من ورم xenografts الإنسان ، وإبراز إمكانيات هذا النموذج لتكون مناسبة للتحليل في الجسم الحي من مجموعة واسعة من الصيغ جسيمات متناهية الصغر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل # 700537 CCSRI غرانت وCIHR المنحة # 84535 لرابطة الدفاع اليهودية والمعاهد الوطنية للصحة / NCI منح # CA120711 – 01A1 – 01A1 وCA120711 إلى الألف إلى الياء. أجريت جميع التجارب وفقا للوائح ومبادئ توجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو ، ورعاية الحيوان واستخدم في جامعة ويسترن اونتاريو.
Materials
| Reagent Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport, VWR | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf model 5810R | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE healthcare life sciences | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Amersham Pharmacia | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE healthcare life sciences | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Biorad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa |
N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR | 16004-300 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR | 25608-203 | |
| Formalin | Bioshop | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher; Tissue Tek | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica CM 3050 S | 14047033518 |
References
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
- Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
- Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
- Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
- Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
- Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
- Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , (2010).
