Summary

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

Published: February 27, 2011
doi:

Summary

Una demostración formal de la disección de un ojo del ratón, lo que resulta en un montaje de todo el epitelio pigmentario de la retina.

Abstract

El epitelio pigmentario retiniano (EPR) se encuentra en la parte posterior del ojo de los mamíferos, justo debajo de la retina neural, que contiene los fotorreceptores (conos y bastones). El EPR es una monocapa de células pigmentadas cúbicas y asociados estrechamente con la retina neural justo encima de él. Esta asociación hace que el RPE de gran interés para los investigadores que estudian enfermedades de la retina. El EPR es también el sitio de un ensayo in vivo de la homología dirigida por la reparación del ADN, la prueba de p de la ONU. El ojo del ratón es particularmente difícil de analizar debido a su pequeño tamaño (alrededor de 3,5 mm de diámetro) y su forma esférica. En este artículo se demuestra con todo detalle un procedimiento para la disección del ojo que resulta en un montaje conjunto de la RPE. En este procedimiento, se muestra cómo trabajar con y no contra, la estructura esférica del ojo. En pocas palabras, el tejido conectivo, el músculo y el nervio óptico se eliminan de la parte posterior del ojo. Luego, la córnea y el cristalino se eliminan. A continuación, se hacen cortes estratégicos que dan lugar a aplanamiento significativo del tejido restante. Por último, la retina neural se levanta suavemente, dejando al descubierto un EPR intacto, que aún está unido a la coroides y la esclera subyacente. Este monte se puede utilizar para realizar el ensayo de la ONU o p para la evaluación de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia el tejido de RPE.

Protocol

1. Eliminar el tejido extraños desde el exterior del ojo Vierta 1X PBS en la tapa de un plato de 35 mm. El nivel debe estar justo debajo del labio de la tapa. El uso de pinzas rectas, los ojos de transferencia (s) del tubo de almacenamiento para el plato de 35 mm. Los ojos se sumergen en PBS, por dos razones: 1. Los tejidos extraños "flotan" fuera del ojo para que pueda ver y quitar con facilidad, y 2. Durante la disección, los ojos, naturalmente, mantienen su forma esférica, mientra…

Discussion

El EPR es el sitio de la prueba de p de la ONU, un ensayo in vivo de la homología dirigida reparación. El ensayo de p de la ONU ha sido utilizado para estudiar los efectos de los daños del ADN diferentes 1,2 y señalización daño en el ADN y los genes de reparación 3,4,5 de la frecuencia de homología dirigida reparación. Este ensayo es muy sensible, la detección de una sola célula eventos en el RPE 1. También puede detectar difer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental [K22ES012264 a AJRB] y una Sociedad Americana del Cáncer InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloto projectaward [a AJRB]. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio de obispo para la lectura crítica del manuscrito y comentarios sobre el vídeo y Brown Adán, en particular, por el ejemplo de qué no hacer. Agradecemos al Dr. Donald McEwen del Cáncer del Instituto de Investigación de Niños Greehey por permitirnos el uso de su microscopio de disección / cámara de video puesta a punto para el rodaje del vídeo de la disección. Damos las gracias a Daron Brown en Instrumentos Corte para el afilado y reparación de nuestras herramientas de microdisección.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
straight forceps   Roboz RS-4903 tip: .08 x .04 mm material: INOX
45° forceps   Roboz RS-5005 tip: .05 x.01 mm material: INOX
15° “up” forceps   Roboz RS-5045A tip: .1 x.06 mm material: INOX
spring scissors   Roboz RS-5604 comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel
binocular dissecting microscope   Ziess Discovery V.8 use reflected light source
phalloidin   Invitrogen A22283 Alexa Fluor 546

References

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Cite This Article
Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (48), e2563, doi:10.3791/2563 (2011).

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