הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

1. פתרונות פתרונות ניתן להכין מראש. פתרונות תאיים ניתן לאחסן 4 ° C למשך חודש אחד. Aliquots של פתרון פנימי ניתן לאחסן קפוא (-20 ° C). ודא כי הפתרונות הן בטמפרטורת החדר לפני תחילת הניסויים. פתרון הביתור, פתרון הקלטה תאיים (mm): 5.8 KCl, NaCl 144; 0.9 MgCl 2, 1.3 CaCl 2; 0.7 לאא 2 PO 4, 5.6 גלוקוז, 10 HEPES: 1 pyruvate Na, pH 7.4 (NaOH), 300 mOsm. עבור IHC Ca 2 + הבידוד הנוכחי פתרון תאיים יכול להיות שונה, כמצוין: 5.8 KCl, NaCl 114; 0.9 MgCl 2, 1.3 CaCl 2; 0.7 לאא 2 PO 4, 5.6 גלוקוז, 10 HEPES; 30 Cl תה: pH 7.4 (NaOH ;) 300 mOsm. Tetrodotoxin 1-2 מיקרומטר (TTX) ניתן להוסיף את הפתרון תאיים לחסום מתח תעלות נתרן מגודרת ולבודד זרמים postsynaptic מעוררים או פוטנציאלים (EPSCs או EPSPs). הקלטה פתרון תאיים (מ"מ): 20 KCl; 110 K-methanesulfonate; 5 MgCl 2, 0.1 CaCl 2; 5 EGTA; 5 HEPES; 5 Na 2 ATP; 0.3 Na 2 GTP; 5 Na 2 phoshocreatine; pH 7.2 (KOH), mOsm 290, או 135 KCl; 3.5 MgCl 2, 0.1 CaCl 2; 5 EGTA; 5 HEPES; 4 Na 2 ATP; 0.2 Na 2 GTP, pH 7.2 (KOH), 290 mOsm. פתרון תאיים על IHC Ca 2 + הבידוד הנוכחי: 135 CsMeSO3; 13 Cl תה: 3.5 MgCl 2, 2.5 Na 2 ATP; 1 EGTA; pH 7.2 (CsOH); 290 mOsm. פתרון זה יחסום את כמות משמעותית של conductances + K הרבה יותר גדול, עוזב Ca 2 + הנוכחי הנותרים. 2. ביצוע עבור מחזיקי רקמות גזור Coverslips השתנה נהגו לקיים הכנה במקום במהלך ההקלטות יכול גם להיות מוכנים מראש. החל ירידה של Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) כלפי קצה coverslip זכוכית עגול (8-12 מ"מ). מניחים את הקצה העבה של סיכה חרקים קנס (FST, פריט לא 26002-10) על coverslip. החזק את הסיכה חרקים בחוזקה על השמשה בפינצטה ומחזיקה ליד סליל מחומם כדי להגדיר את sylgard. 3. ביצוע אלקטרודות הכן אלקטרודות טרי בכל יום ניסיוניים לאחסן בקופסה אטומה. לפברק 10-20 אלקטרודות להכנת כל אחד. בחר זכוכית אלקטרודה, אנו משתמשים 1 מ"מ בורוסיליקט זכוכית נימים (1B100F-4 מ WPI, סרסוטה, פלורידה). עיצוב תוכנית על חולץ רב צעד למשוך אלקטרודות בקוטר טיפ של כ 2-3 מיקרומטר (~ 6 MΩ בפתרונות שתוארו לעיל). אנו משתמשים סאטר P-87 רב שלבי חולץ אופקי או אנכי Narishige PC-10 חולץ. בזהירות המעיל שוק של האלקטרודה עם Sylgard קרוב לקצה האפשרי. זה מקטין קיבול פיפטה ורעש הקלטה ממזער. Fire-פולנית האלקטרודות באמצעות microforge עם נימה סוער כמו זה זמין WPI. אלקטרודות אש מלוטש צריך קוטר קצה החיצוני של כ 1 מיקרומטר (10-15 MΩ בפתרונות שתוארו לעיל). עובי הקיר פיפטה הוא כ 1 / 3 מיקרומטר. הקוטר החיצוני יש בערך בגודל של באוטון מביא להיות תוקנו. במקרה של ביצוע הקלטות סימולטני: IHC פיפטה צריך להיות בנוי בצורה דומה (אותה כוס, התוכנית מושכת אותו), בהצטיינות, כי ליטוש אש צריך להשאיר טיפ גדול יותר בקוטר של כ 3 מיקרומטר (6-8 MΩ). 4. הגדרת הניסוי מילוי החדרים מחוברים למערכת המחשב, הכבידה זלוף נמאס פתרון תאיים פתרונות בדיקה המכילה סמים או רעלים של עניין. הגדר זלוף כך נפח אמבט הוא כ 2 מ"ל, כל הזמן perfuse בקצב בסדר גודל של 1.5 מ"ל min-1. אם פתרונות שונים כדי להיות מיושם במהלך הניסוי עם מערכת טפטוף מקומי, למלא מאגרי עם פתרונות. הפעלת פתרונות באמצעות המערכת ולוודא כי אין בועות אוויר. 5. Dissection ואת הכנת המדגם הסרט מלווה ממחיש את דיסקציה של האיבר של קורטי במשך שלושה שבועות חולדות הישן (ספראג Dawley, צ'ארלס ריבר), אשר קשה יותר מזו של שלבי הלידה מוקדם יותר. היתרונות והחסרונות של הקלטה של ​​חולדות בגילאים שונים נבדקות בדיון. עמוק לטשטש את העכברוש משאיפת isoflurane. כאשר הרפלקסים נסיגה נעדרים ורפלקסים הקרנית מדוכאים קשות, לערוף. נהלים אלה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ג'ונס הופקינס ועדת שימוש. הסר את החרטום ואת העור מפני ראשו הכרות. לחצות את הראש ולהסיר את המוח כדי לחשוף את עצמות הזמני. הסר את שתי עצמות הזמני מקום לנתח מנות נקי המכיל תאי פתרון סטנדרטי. להסירעצם encapsulating העצם הטמפורלית כדי לחשוף את השבלול. החזק את העצם הטמפורלית מאובטח בבסיס עם זוג מלקחיים. זהה את חלונות עגולים סגלגל. להתמצא שבלול כך את החלון הסגלגל לצד מתפתלת של הפנים כלפי מעלה שבלול ולהסיר עצם עודף סביב שבלול. הסר את העצם encapsulating שבלול לחשוף את האפיתל חושית, מקפיד להגן על סליל apical, אשר ישמשו לצורך הניסוי. השתמש בזוג השני של מלקחיים בסדר שבב העצם ישירות את שבלול, החל באזור זה הוא שקוף יותר משאר העצם. הנה העצם הוא דק יותר וקל יותר להסיר. המשך הסרת עצם סביב הסליל apical. השתמש מיקרו לנתח מספריים לחתוך את כישור מתחת להפוך את apical. ואז לנתק את להפוך apical מ פונה התחתון של שבלול. השתמש מיקרו לנתח מספריים שוב, במידת הצורך, כדי להבטיח להפוך apical הוא ניתק לחלוטין. תשמרי על עצמך כדי להגן על סליל apical, זה לא צריך להיות משך או מתוח. השתמש מלקחיים בסדר לשדל את התור apical משאר שבלול. הסר את משענת של העצם משני צידי להפוך את apical. הסר בזהירות את vascularis stria, רצועת מבריק של רקמת ממוקם מחוץ לאזור השיער תא (סכמטי 1). הקפד להימנע הסרת תאים שיער חושית, אשר יכול בקלות להיות מנותקת יחד עם vascularis stria. שימוש במלקחיים בסדר לנתק את קרום tectorial, מבריק, שקוף למחצה, כי יושב מעל קרום התאים שיער חושית. עכשיו לקצץ רקמת העצם עודף ולשטח ההכנה עם מלקחיים. זה הכרחי, כך רקמה ניתן להציב באופן שווה תחת סיכה. מניחים את הכנת תחת הסיכה המצורפת coverslip (שהוכן קודם לכן), דואג למצב את הסיכה מן התאים שיער. שימוש במלקחיים להעביר את coverslip לתא הקלטה. ודא רקמה שבלול מכוסה לחלוטין עם ירידה של פתרון תוך תאיים העברת coverslip. לחצו על coverslip בחוזקה כלפי מטה על תחתית כוס של החדר כדי לוודא שהוא לא זז במהלך ההקלטה. מיד להתחיל זלוף עם פתרון תאית, כדי להבטיח הישרדות טובה יותר של ההכנה. 6. הקלטה אתר את הכנת דרך מהעיניות מיקרוסקופ באמצעות 10x ו 40X הטבילה במים מטרות DIC. להתמצא הכנת כך אלקטרודות הקלטה יכול להתקרב IHCs orthogonally אל הקיר לרוחב של IHC. אם ההכנה היא מכורבלת על, להגביל את הראות באזור הבסיס של IHCs, להשתמש אלקטרודה הקלטה לדחוף את הקצה החיצוני של הכנת מטה נגד coverslip הזכוכית, מקפיד להימנע לחיצה על IHCs עצמם. * אם באמצעות חולדות צעירות, בשלב זה שכבה עבה של תאים תומכים מעל בתאי השיער ניתן להסיר עם טפטפת ניקוי (בקוטר קצה ~ 10-20 מיקרומטר) כדי לקבל גישה לתאי חושי 1, 12. השתמש לפקח להעריך אם הרקמה היא בריאה. באמצעות עדשה ההגדלה 4X בין מיקרוסקופ ואת המצלמה NC70 Newvicon נוספת מגדילה את התמונה פרויקטים על שטח של כ – 4,800 מיקרומטר 2 על המסך. תאים שיער צריך להיות מוארך עם צרורות שיער ללא פגע. כאשר הרקמה מידרדר, בתאי השיער להתנפח נעשים שקופים יותר מגורען. בתרגום boutons מביא סביב בסיס IHCs. Boutons הם כדוריים או אליפסואידי, כ 1 מיקרומטר בקוטר בהיר עם מראה מבריק. רוב boutons הם נקודתיים מתחת לרמה של הגרעין. כאשר הרקמה boutons בריא להתנפח כ 4 פעמים גודל נורמלי להיות שקוף ולא מבריק. מלאו אלקטרודה הקלטה עם פתרון תאיים, להפעיל לחץ חיובי ולהשתמש micromanipulator לתמרן את האלקטרודה הכנת. עושים חתך הכנה ברמה של בסיס IHC עם האלקטרודה. דחוף את האלקטרודה בין שכבה דקה של תאים תומכים ואת IHCs, באמצעות לחץ חיובי ליצור נתיב גישה לאזור בבסיס IHCs. שלב זה הוא "מפתח" להגעה באוטון מביא וגם לא הקלטת מתמיכה תאים בחוזקה ensheath קצות מביא. הסר בזהירות את האלקטרודה ולהחליף האלקטרודה מלא טרי. באמצעות לחץ חיובי לשמור על קצה האלקטרודה נקייה, לתמרן את האלקטרודה דרך החור גישה הממברנה של IHC. הלחץ החיובי צריך לסייע נע סביב התאים התומכים המקיפים את IHCs. הזז את האלקטרודה סביב תאים סמוכים תמיכה לקראת באוטון מביא (כפי שמוצג בסרט המלווה. גישה חלופית היא הגישה באוטון מביא על ידי הזזתזמן הממברנה IHC עד קצה האלקטרודה נוגעת באוטון). ודא קצה האלקטרודה הוא ישירות מול באוטון מביא (יש עדיין פער קטן בין באוטון לבין האלקטרודה עקב הלחץ חיובית על פיפטה). Boutons מציעים עמידות יותר תנועה של פיפטה מאשר תאים תומכים הממברנה IHC, הם יכולים להיות "הרגיש" על ידי הנסיין. פיפטה העבר מעלה ומטה לדחוף לוודא כי המהלכים באוטון. זה מצביע על כך את קצה פיפטה ו באוטון נמצאים על המטוס-Z אותו. עם האלקטרודה נלחץ באוטון מביא, במקביל לשחרור לחץ חיובי וליישם יניקה כדי ליצור חותם GΩ. כינונה של חותם GΩ על באוטון מביא דומה על תא השיער. היווצרות Seal יכול להיות מהיר או עשוי להתרחש לאט. החל מתפרצת של שאיבה עדינה כדי לקרוע את קרום בתוך האלקטרודה והזן את תצורת כל הקלטה התא. אם התא תוקנו הוא מביא באוטון, הארעיים capacitative קטן יופיע על הדופק לבדוק מרובע להשגחה במהלך היווצרות חותם (ראה איור 1). אנו מעריכים את הקיבול של סיום מביא להיות 0.4-1.8 pF (ראה 3, 4). אם התא תוקנו הוא IHC, הארעיים יהיה בסדר גודל של 3-5 פעמים גדול בהתאם התנגדות גישה. כדי לאשר כי התא הוא מביא באוטון, לנהל פרוטוקול עם hyperpolarizing ו depolarizing צעדים מתח. היחסים מתח הנוכחי (IVs) עבור סיבים מביא ו IHCs (תוקנו לעתים קרובות בטעות כאשר מכוונים באוטון מביא) אופייניים של סוגי תאים בודדים מוצגות באיור 2. צג פוטנציאל הממברנה; עבור סיב מביא, זה בדרך כלל בסביבות mV -60 ל -65. אם התא אינו מביא באוטון, להסיר אלקטרודה וחזור על שלבים 8-13 עם אלקטרודה מלא טרי. השתמש אלקטרודה חדשה עבור כל ניסיון. צג התנגדות הסדרה ברחבי ההקלטה על ידי יישום הצעדים מתח על מנת להבטיח כי החותם לא עומד להיסגר. אם ההתנגדות סדרה עולה, זה יכול להיות מועיל ליישם פולסים עדין של יניקה או להעביר את האלקטרודה מעט לאחור. התנגדויות סדרה הם בדרך כלל סביב 30 MΩ. בניתוח הפעילות הסינפטית, אנו להשליך הקלטות עם התנגדויות סדרה יותר מ 50 MΩ. עכשיו אתה יכול להקליט הפעילות הסינפטית (ראה איור 3). או סיבים מביא תערוכות פעילות ספונטנית, או תא השיער צריך להיות depolarized להפעיל לשחרר משדר. יישום פתרון תאי עם ריכוז אשלגן גבוה יותר (למשל 40 מ"מ) יהיה depolarize התא השיער לעיתים קרובות להפעיל או להגביר את קצב שחרור משדר. עבור הקלטות סימולטני של IHCs ו boutons מביא 2, ההליך צריך להיות שונה באופן הבא: המשך הצעדים 1 עד 5. מלאו פיפטה IHC את הפתרון המתאים עבור תאיים Ca 2 + בידוד הנוכחית ופעל כפי שצוין 6. השאירו את פיפטה הקלטה IHC ב "העמדה מחכה" קרוב IHC שיירשמו מ. המשך עם שלבים 6 – 14 עבור הקלטה מביא. כאשר פיפטה מביא הוא בתצורת התא כולו להמשיך עם פיפטה IHC. התמרון פיפטה second לכיוון הקיר לרוחב של IHC המקביל, תמיד שמירה על לחץ חיובי. IHC צריך להראות הכניסה על הקיר לרוחב באמצעות הלחץ ואת זה צריך להיות מובטח כי התאים התומכים מופרדים ממנו. שלבים 12-13 יכול להיות מיושם על IHC גם כן. כפי שצוין ב 14, לעומת סיבים מביא, הארעיים קיבולי גדולים הם סימן ההיכר של הקלטה IHC, בנוסף היחס IV אופייני. לאחר ההקלטות סימולטני מבוססים, כמה זמן צריך להיות מותר (3 – 5 דקות, תלוי התנגדות סדרה) פתרונות תאיים לשטוף לתוך IHC. זה יגרום יותר Ca 2 + זרמים בשל לחסום הגוברת של conductances + K הרבה יותר גדול. כדי לבצע משוחרר חותם הקלטות תאית, בכל שלב 12, במקום לבצע חותם GΩ, לעשות חותם רופפת של 30 עד 50 MΩ על באוטון מביא. זו יכולה להיות מושגת על ידי הפעלת יניקה פחות תוך שחרור לחץ חיובי. ראה איור 5 למשל הקלטה של ​​תאית מן באוטון p21 עכברוש מביא. 7. צרות הירי אם חותמות יכול להיווצר, אבל את המעבר מן התא מחוברת הקלטה התא כולו לא ניתן להשיג, הקוטר הפנימי של פיפטה עשוי להיות צר מדי. אם חותמות הדוק לא יכול להיווצר, הקוטר הפנימי פיפטה עלול להיות גדול מדי באוטון כל יכול להישאב אל האלקטרודה. אם כל האירועים הסינפטי הם קטנים מדי, הקלטה ניתן תאיים על מביא. מבחן היפוך של אירועי פוטנציאל הממברנה חיובי; רשמה intracellularlyEPSCs יבטל את הפוטנציאל החיובי. אם התנגדויות סדרה גבוהים באופן עקבי כאשר מסופי מביא תיקון, נסה להעביר את פיפטה אחורה לפני שתנסה לפרוץ לתוך תצורת התא כולו. זה עוזר למנוע סתימת פיפטה והתנגדות גישה גבוהה. מיקום נכון של פיפטה ללא מורא. ניתן להזיז את אלקטרודה כדי להפחית את התנגדות סדרה גבוהה או סתימת פיפטה בלי "לאבד" את החותם על מביא. במהלך הקמת הקלטה בו זמנית, IHC הוא בדרך כלל "דחף" לקראת באוטון. עמדת פיפטה מביא ניתן לתקן בהתאם. 8. נציג תוצאות באיור 1. AB. הארעיים אופיינית רשמה סיב מביא (א) ו IHC (ב ') בתגובה mV 10 hyperpolarizing הפקודה מתח מ מתח אחזקה של mV -94. בשל קוטר פיפטה צר התנגדות גישה גבוהה, הקלטה IHC (B) הוא הכי מוצלח עבור הקלטת כל תא IHC. ההקלטה מוצג כאן רק כדי להמחיש את ההבדל בין הארעיים capacitative מ IHCs וסיבים מביא. זה יכול לעזור להבדיל בין סוגי תאים כאשר להרכיב את התצורה כל תא. Whole-cell הארעיים capacitative מ IHCs הם בסדר גודל של 5 פעמים גדול יותר מאשר משרעת מסיבים מביא. תקליטור. הארעית של A & B המוצג זמנים מורחבת. ג הדעיכה של התגובה מביא יכול להיות מתאים עם שני exponentials. קיבול של סיום מביא נאמד ממרכיב מהר. 2. איור IV היחסים בין באוטון מביא (א) ו IHC (B). יחסי IV נרשמות מן הפוטנציאל אחזקה של mV -84 בצעדים מתח מ -124 ל mV mV 36 + ב 10 במרווחים mV (מתח נומינלי). מתח מוצגים בצד ימין של כמה עקבות. הקלטות אלה בוצעו עם KCl mM 5.8 תאיים בטמפרטורת החדר. סולם עבור שניהם: 500 הרשות הפלסטינית, 200 ms. . IV היחסים בין סיב מביא בכל יום לאחר הלידה 19. EPSCs נוכחים במהלך רוב השלבים מתח; EPSCs הפוכה חיובית mV 6. הקלטה זו בוצעה בנוכחות TTX לחסום מתח מגודרת Na + זרמים. הערה הנוכחי פנימה לאט הפעלת במתח hyperpolarizing (אני ח). זרם זה אינו קיים ב IHCs או תאים תומכים מספק אינדיקציה טובה כי התא רשמה הוא סיב מביא (ראה 3). B. IV יחסי מתוך IHC P19. בשל קוטר פיפטה צר התנגדות גישה גבוהה, הקלטה הוא הכי מוצלח לאפיון IHC זרמים זרמים קטנים מהצפוי. ההקלטה מוצג כאן רק כדי להדגים את היחסים הרביעי של IHCs וסיבים מביא ניתן להבחין בבירור, כאשר ההקלטה סיבים הוא מביא ניסיון. הערה המהיר החוצה הפעלת K + זרמים בכל פוטנציאלים חיובי (חץ) ואחריו מתעכב rectifier K + זרמים 13. איור 3. וזרמים דוגמה מובהקת הסינפטי רשמה סיב מביא ביום הלידה 21 בנוכחות + K 40 מ"מ תאיים להגביר את קצב שחרור מן IHC. בטמפרטורת החדר, עם TTX להחיל לחסום מתח מגודרת Na + זרמים.. 200 סולם הרשות הפלסטינית, 5 ms, שים לב לגודל הצורה משתנה של EPSCs. לתיאור מפורט של מאפייני EPSC לראות 4. B. שני EPSCs מסומן (#: multiphasic, o: monophasic) הראו בהיקף מורחב: 100 גודל הרשות, 1 ms. איור 4. סימולטני הקלטה של IHC ויצירת קשר באוטון מביא באיבר עכברוש נכרת של קורטי, יום לאחר הלידה 10 (ראה גם 2). צעד מתח depolarizing IHC מעורר שחרור של הנוירוטרנסמיטר ומפעיל EPSCs ב באוטון מביא עקבות עליון:. בפרוטוקול מתח עבור שלילת קוטביות IHC. אחזקות פוטנציאל: mV -79, 50 ms צעד כדי mV -29 עקבות התיכון. L-סוג Ca 2 + זרמים מוקלט מן IHC בדרך כלל להראות איון קטן ולהפעיל את הפוטנציאל השלילי עקבות תחתונה:. וזרמים Synaptic בסיבים מביא בתגובה כדי שלילת קוטביות IHC. שים לב דיכאון הסינפטי במהלך שלילת קוטביות 50 IHC ms. איור 5. . ההקלטה דוגמה מובהקת תאיים מ באוטון מביא בכל יום לאחר הלידה 21. זו נרשמה בטמפרטורת החדרture, עם 5.8 + K תאיים מ"מ. הקלטה זו יש אות אופייני יחס רעש להקלטת כהכנה מן החולדה שלושה בשבוע הישן. B. Waveform ממוצע לאירועים תאיים רשמה באוטון P20 מביא. זוהי צורת הגל הממוצע של 10,272 האירועים. סכמטי 1. הצלב להציג חתך דרך להפוך לאחד שבלול עכברוש הממחישות את הקשר האנטומי בין התאים השיער הפנימיים והחיצוניים, הגרעינים ספירלה, קרום stria vascularis ו tectorial.