Summary

Saggio espressione di superficie dei recettori chemosensoriali in cellule eterologhe

Published: February 23, 2011
doi:

Summary

Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l'espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.

Abstract

Il mondo vivido degli odori è riconosciuto dal senso dell'olfatto. Olfatto nei topi è mediata da un repertorio di circa 1200 recettori delle proteine ​​G accoppiate (GPCR) 1 che sono postulate di legare molecole odoranti volatili e convertendo il segnale extracellulare in un segnale intracellulare mediante accoppiamento con proteine ​​G Gαolf. Legame del odoranti ai recettori si pensa di seguire una regola combinatoria, cioè, un odorizzante può legare i recettori diversi e un recettore può legare odori diversi a vari livelli 2. Biochimiche, di segnalazione e studi di binding ligando sono stati opportunamente eseguiti per la maggior parte GPCR utilizzando cellule eterologhe. Tuttavia l'uso di cellule eterologhe per lo studio dei recettori olfattivi, è stato precluso per molto tempo da quando il transfezione non sono riusciti ad esportare verso la superficie. Saito et al hanno dimostrato singolo passaggio del recettore di membrana Il trasporto delle proteine ​​(RTP) accompagnatori famiglia mostrano maggiore espressione nei neuroni olfattivi e sensoriali agiscono come accompagnatori di recettori olfattivi traffico in superficie in cellule eterologhe, quando co transfettate insieme 3. Per effettuare test biochimici per i recettori utilizzando cellule eterologhe, si deve prima determinare se il recettore mostra espressione robusta superficie nella linea cellulare. Questo può essere dosati con iperespressione del recettore con i RTP1S chaperone seguita da cellule vive colorazione fluorescente di etichettare il dominio extracellulare o di un tag nel dominio extracellulare in esclusiva. Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l'espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.

Protocol

1. Procedimento: La procedura si compone di tre parti completato in un tempo totale di 3 giorni: il trasferimento di cellule, trasfezione e immunocitochimica, un passo effettuato al giorno. Trasferimento e trasfezione delle cellule nei primi due giorni deve essere effettuato in condizioni sterili in una camera a flusso laminare. 1 ° giorno: Trasferimento di cellule HEK293T per test espressione sulla superficie. Trasferimento medio (M10): Mix minimo mezzo…

Discussion

Ogni passo deve essere effettuata con cura per garantire la colorazione della superficie prominente e distintivo. L'intero processo di colorazione deve essere eseguita a freddo (su ghiaccio), e il vassoio su cui sono previsti slittamenti di copertura deve essere raffreddato prima dell'uso per assicurare cellule rimanere in vita. Inoltre la fissazione avviene al termine del processo di colorazione della superficie. Ciò è in netto contrasto con la colorazione interna in cui la fissazione precede colorazione a pe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i membri della Matsunami laboratorio per la lettura critica di questo manoscritto.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cover slip 22 X 22 mm (#1)   Thermo Scientific 72200-11  
Fetal bovine serum   Gibco 16000  
Lipofectamine 2000   Invitrogen 11668-019  
Minimal essential medium   Sigma M4655 With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate
Mowiol   Calbiochem 475904  
Paraformaldehyde   EMS 19208  
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X   Gibco 14025 With calcium chloride and magnesium chloride
HEPES Buffer Solution   Gibco 15630  
Phosphate Buffer Saline (PBS)   Cellgro 21-040-CV Without calcium and magnesium
Poly D Lysine Hydrobromide   Sigma P7280  
Sodium Azide   EM Science SX0299-1  
Tissue culture dish 35 X 10 mm   Falcon 353801  
Trypsin-EDTA   Gibco 25300 0.05%

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
  2. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
  3. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
  4. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).

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Cite This Article
Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells. J. Vis. Exp. (48), e2405, doi:10.3791/2405 (2011).

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